研究背景和目的：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种病因未明、免疫功能紊乱、进而导致组织器官损伤的自身免疫性疾病,临床表现复杂,以女性较常见,男女发病比一般为1：9。SLE发病呈全球不均匀分布,在中国人中患病率高达92.9/10万。SLE病因和发病机制至今未明,目前认为病因与遗传背景、环境因素、性激素、感染和药物等因素密切相关,在上述诱因作用下,机体出现免疫异常,包括淋巴细胞功能异常、细胞凋亡的缺陷、信号转导的异常以及细胞因子的分泌异常,使正常的免疫耐受机制破坏,自身抗体的大量产生及免疫病理损伤,最终导致SLE的发生。目前,淋巴细胞功能及其分泌细胞因子的异常是SLE发病机制的研究热点。调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)是一类不同于Thl和Th2的、能够抑制其他免疫细胞活化和增殖的T细胞亚群,能通过细胞接触和分泌细胞因子下调免疫反应,在自身免疫耐受、自身免疫性疾病、肿瘤免疫和器官移植中发挥重要作用。调节性T细胞有多种亚型,其中TCRαβ+CD4-CD8-T细胞(DNT细胞)是一种新发现的调节性T细胞亚型。DNT细胞在人外周淋巴组织中所占比例极低,约为1%-2%,在外周血中占CD3+T细胞的1%左右。目前已证实,DNT细胞具有下调自体和异体免疫反应、诱导免疫耐受和调节自身免疫的功能。DNT细胞作为一种抑制性调节T细胞在一些自身免疫性疾病中是降低的,但是,文献报道DNT细胞在SLE病人外周血中是显著升高的。目前,关于DNT细胞在SLE病人中的作用及其作用机制仍不清楚,有人认为其在正常范围内可起免疫抑制作用,数量增多时,对疾病的发生起重要作用。IL-17主要由活化的T细胞产生的一种致炎细胞因子,可以促进T细胞的激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)及细胞黏附分子1(CAM-1),从而导致炎症的产生。IL-17还是一种前致炎因子,可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。IL-17与受体结合后,可通过MAP激酶途径和核转录因子κB(NF-κB)途径发挥其生物学作用。许多细胞亚群包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、NK细胞以及中性粒细胞等都可以产生IL-17。辅助性17型T细胞(Thl7),特异性产生IL-17效应分子,在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。大量研究表明,IL-17在人炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病过程中发挥重要作用,与人的自身免疫性疾病如风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、肠炎性疾病(IBD)、银屑病(psoriasis)及系统性红斑狼疮(SLE)存在密切关系。最新研究发现,在SLE病人血清及PBMC培养后的上清中均存在大量IL-17,在狼肾病人肾组织中亦发现IL-17的大量聚集,并且升高的IL-17与疾病严重程度显著相关。Crispin等研究了SLE病人的CD4+ T、CD8+ T和DNT三种细胞亚群IL-17A、IL-17F、tisoform of RORC和IL-23R的表达水平,发现DNT细胞高表达IL-17A、IL23R以及ROR-γt,并在狼疮肾炎病人的肾组织中发现了DNT细胞和IL-17+T细胞的浸润,因此认为DNT细胞及其IL-17的过量分泌在SLE病人的发病中起重要作用。有关DNT细胞在SLE病人中的致病作用及作用机制研究的相关报道,目前查获的文献极少,国内未见报道。为证实DNT细胞在中国人群SLE病人发病中的作用及作用机制,本课题拟以SLE病人为研究对象,检测其DNT细胞数；分析DNT细胞与病人临床实验室诊断指标的相关性,并探讨其与病人疾病严重程度(SLEDAI)的相关性。检测SLE病人DNT细胞分泌的胞内因子IL-17,并探讨其与SLE疾病的关系,从而为DNT细胞在SLE病人中的作用及致病机制提供实验室依据。方法1.研究对象：广州南方医院皮肤科、中医科和风湿科2009年10月-2010年6月期间住院SLE病人64例,所有SLE病人诊断均符合1997年美国风湿病协会(ARA)修订标准,其中男性6例,女性58例,年龄11-59岁,平均年龄30±12岁,疾病分期及狼肾诊断依据SLE诊断研究委员会标准,计算病人疾病活动指数(SLEDAI),<5为疾病低度活动期,5-10为中度活动期,>10为高度活动期,尿蛋白>0.15g/24h或>+++为狼肾患者。类风湿(RA)病人对照组选择13例,所有RA病人均符合1987年美国类风湿病协会(ARA)修订标准。正常对照组选择16例健康人,男性1例,女性15例,年龄18-52岁,平均年龄30±11岁,均无自身免疫性疾病史。研究对象均为中国人,无亲缘关系,各组间性别和年龄均匹配。2.研究方法：2.1流式细胞术检测SLE病人外周血中DNT细胞的表达数采集SLE病人肘部外周静脉血2ml,肝素钠抗凝,轻轻混匀,各取10μl荧光标记单克隆抗体FITC-anti-human-CD4抗体、FITC-anti-human-CD8抗体和PE/Cy5-anti-human-TCRa/β抗体,取100μl混匀的全血细胞,混匀,室温避光20min,同时设置对应的阴性及同型对照IgGl-FITC/IgGl-PE/IgGl-PE/Cy5,溶血后上机进行DNT细胞计数。2.2 SLE病人临床实验室诊断指标的血清学和尿液的检测收集SLE病人血清及尿标本,OLYMPUSAU5400全自动生化分析仪检测病人血清中C3、C4和总补体,Sysmex2401全自动尿液分析仪检测尿红细胞、尿白细胞和尿蛋白,ELISA法检测抗ds-DNA抗体,全自动血沉仪检测血沉(ESR)。2.3流式细胞术检测DNT细胞分泌的胞内因子IL-17我们在检测DNT细胞分泌的胞内因子IL-17时发现,随着刺激物(如：PMA+Ionomycin)浓度的增加和刺激时间的延长,细胞表面抗原CD4显著下调,TCRaβ+CD8-CD4+ T变为TCRaβ+CD8-CD4+T细胞,混入DNT细胞群内,进而影响了对DNT细胞分泌的细胞内因子IL-17的检测。目前,实验中多采用流式和(或)磁珠分选目的细胞,或反定义(CD4+ T=1- CD8+ T)的方法设门CD4+T细胞群,但是前者对仪器和操作者要求较高,需要大量人力物力,后者由于目的细胞群中混入其他细胞,结果会产生较大误差。为此,我们摸索了一套简便的方法,用于检测DNT细胞分泌的IL-17。收集SLE病人外周肝素钠抗凝血,佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)联合刺激,依据BD FastImmune细胞内因子检测试剂盒实验流程,利用本实验室改进方法,直接对全血中刺激后的DNT细胞分泌的胞内因子IL-17进行检测。本实验室改进方法的原理及流程：3.统计方法流式细胞术检测时,每次均设置对应的阴性对照及同型对照,CellQuest软件(BD公司)分析流式结果。所有数据分析均采用SPSS13.0处理,所有计量资料用均数±标准差汀±s)表示,方差齐性用Levene检验,两组间均数比较用独立样本t检验。One-Way ANOVA多重比较中,方差齐性采用Welch法,方差齐时采用Bonferroni法,方差不齐时采用Dunnett’T3法检验。双变量相关分析中,计量资料用Pearson法,等级资料用Spearman方法检验,取α=0.05为检验标准。结果：1.与正常人(0.93±0.45)和RA病人(1.20±0.69)相比,SLE病人外周血中DNT细胞数量(2.29±1.25)显著升高,P=0.000,在低度(1.90±0.90)、中度(2.76±1.34)、高度(2.53±1.48)活动期病人中DNT细胞数量均显著升高,P均<0.005。SLE疾病不同活动期病人组间两两比较,与低度活动期组比较,中、高度活动期病人外周血中DNT细胞数量均显著升高,P<0.05,而中度与高度活动期病人组之间差异不明显,P>0.05。SLE病人不同分组之间的比较,狼肾病人(2.27±1.21)外周血中DNT细胞数量较非狼肾病人(2.32±1.40)升高不明显P>0.05,但是,尿蛋白阳性病人(2.73±1.41)外周血中DNT细胞数量显著高于尿蛋白阴性病人(1.68±0.73),P=0.006。2.SLE病人外周血中DNT细胞与其血清中补体C3、C4、总补体及抗ds-DNA抗体、ESR无相关关系,与尿中红、白细胞和蛋白有相关关系,P分别为0.002、0.033、0.014,与病人的SLEDAI有相关关系,P=0.021。3.采用本实验室的改进方法,检测病人外周血中淋巴细胞分泌的IL-17。与活化的正常人外周血CD4+T细胞(1.76±0.89)、TCRαβ+T细胞(2.13±0.95)及DNT细胞(1.88±0.96)分泌的IL-17相比,SLE病人中CD4+T细胞(3.95±2.41)、TCRαβ+T细胞(3.39±1.2)及DNT细胞(3.48±1.71)分泌的IL-17均显著升高,P<0.05。DNT细胞分泌的IL-17在尿蛋白阳性病人(5.04±1.69)与尿蛋白阴性病人(2.93±1.70)中存在显著性差异,P值<0.05,而CD4+T细胞和TCRαβ+ T细胞分泌的IL-17在两组间未发现显著性差异。4.采用本实验室改进方法,不需对CD4+T细胞、TCRαβ+ T细胞、DNT细胞进行流式或磁珠分选,而是直接取病人外周血进行刺激后,对各群细胞进行准确设门和胞内因子IL-17的检测。结论：1.SLE病人外周血中DNT细胞数量较正常人显著升高,在疾病各活动期存在差异。2.SLE病人外周血中DNT细胞数量与疾病严重程度显著相关,可以作为疾病发展监测的指标之一3.SLE病人外周血中异常升高的DNT细胞及其产生更多的IL-17可能在病人的病理机制中发挥重要作用,并且可能参与了病人早期器官损伤。4.采用本实验室胞内因子检测方法,可使实验数据准确,重复性好,对实验室要求不高,有利于在临床普及。本研究创新点：1.分析了DNT细胞在不同疾病活动期SLE病人外周血中的表达。2.探讨了DNT细胞与SLE病人血清学和尿液的相关性分析,为DNT细胞参与SLE肾脏损伤提供临床证据。3.国内首次报道DNT细胞作为抑制性调节细胞在SLE病人中通过分泌炎症因子IL-17发挥致病作用。首次发现DNT细胞的表达及其分泌的IL-17在尿蛋白阳性病人与尿蛋白阴性病人间存在显著性差异。4.DNT细胞或与CD4抗原分子相关的细胞未经流式或磁珠分选,直接刺激后,采用本实验室改进方法检测其分泌的细胞胞内因子,使研究数据和结果更加可靠准确。该方法简便经济,重复性好,有利于普及临床胞内因子的检测。