非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝细胞内脂肪过度沉积,排除饮酒和其他明确的损肝因素导致的临床病理综合征,目前尚无确切和疗效显著的NAFLD治疗方法,尽管吡格列酮和维生素E得到国际社会的认可,但也存在一定的副作用。海洋生物活性肽具有功能独特、结构新颖的特点,利用海洋生物资源开发出生物活性功能肽是近年来研究的热门课题。鳕鱼(gadus)作为世界上捕获量最大的鱼类之一,其鱼肉常用于制作鳕鱼片,而鳕鱼皮则作为下脚料被丢弃。研究发现鳕鱼皮中含有丰富的胶原蛋白,提取的胶原蛋白活性肽已在很多领域得到了应用,但对NAFLD是否有修复作用目前尚未见报道。本实验应用酶解方法制备鳕鱼皮胶原蛋白肽(Cod skin collagen peptide,CSCP),研究其对NAFLD细胞模型和小鼠动物模型的修复作用,为开发一种新型的、对NAFLD有修复效果的护肝类保健品提供实验依据。本研究应用油酸对Chang liver细胞进行诱导,通过MTT法检测Chang liver细胞活性,倒置显微镜观察、油红O染色以及GPO-PAP酶法测定细胞中TG含量为指标建立体外NAFLD细胞模型。以NAFLD细胞中的TG含量为标准对鳕鱼皮进行最佳酶种筛选,应用单因素和正交实验确定酶解的最佳工艺,经超滤制备高活性的CSCP,探究其体外抗氧化能力。获得的CSCP作用于NAFLD细胞模型中,测定正常组、模型组、CSCP低剂量组(40μg/mL)和CSCP高剂量组(80μg/mL)培养液中AST、ALT、MDA、SOD、GSH、CAT、ROS含量变化;透射电镜观察细胞超微结构来评价CSCP对NAFLD细胞模型的修复作用。以小鼠为实验动物,分为正常组、模型组、洛伐他汀阳性对照组(剂量为8 mg/kg/d)、CSCP低剂量组(200 mg/kg/d)和CSCP高剂量组(400 mg/kg/d)。除正常组外,其它各组均在高脂饲料喂养建立的NAFLD小鼠模型上进行灌胃给药。观察小鼠的一般行为状态与体重变化,实验结束取血清与肝脏,计算肝重指数,测定小鼠血清中AST、ALT、HLD、DLD、TG的含量以及肝组织匀浆液中SOD的含量;HE染色和透射电镜判断小鼠肝脏的组织结构改变情况。实验结果:1.MTT法结果显示当油酸浓度为0.25 mmol/L,作用24 h后Chang liver细胞的存活率最高,倒置显微镜观察细胞中的空泡明显增多;油红O染色结果显示此时细胞中的脂滴出现了明显融合,且细胞生长形态较好;细胞中的TG含量明显升高,表明NAFLD细胞模型成功建立。2.制备CSCP的最佳酶解工艺为:碱性蛋白酶为最优酶种,料液比为1:2,pH值为9,加酶量2000 U/g,温度50℃,时间为10 h;制得的酶解液经超滤截留<1 KDa的分子段,可使细胞中的TG含量显著降低,该分子段的多肽即为本实验所用的CSCP。3.CSCP的体外抗氧化结果显示,CSCP对DPPH、羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基具有较好的清除效果,表明CSCP具有很好的抗氧化活性。4.体外细胞实验结果显示,相比于模型组,CSCP加药组细胞中的AST、ALT、MDA、ROS的含量下降,且呈现剂量相关性,SOD、GSH、CAT的含量较模型组有所上升。透射电镜结果显示正常组细胞具有较多的微绒毛,而模型组细胞微绒毛数量减少,有明显脂滴。加药组细胞中脂滴含量明显减少,微绒毛数量明显增多,特别是高剂量组的变化更明显。5.体内小鼠动物实验结果显示,CSCP可降低模型组小鼠血清中AST、ALT、DLD和TG的含量,使HLD的含量升高,肝组织匀浆中SOD的含量有下降的趋势。HE染色结果显示,模型组小鼠肝细胞内出现较多的空泡脂滴,阳性药物组和CSCP药物组得到了较大改善,肝索结构与肝细胞形态接近于正常。透射电镜结果显示,模型组肝细胞内有许多电子密度较低的圆形脂肪滴颗粒,CSCP药物组和阳性药物组脂滴明显减少,线粒体增多,对肝组织修复作用明显。实验结论:当油酸浓度为0.25 mmol/L,作用Chang liver细胞24 h后可建立NAFLD细胞模型,经碱性蛋白酶酶解制备得到的<1 kDa分子段的CSCP可以有效降低NAFLD细胞模型中AST、ALT、MDA和ROS的含量,升高细胞中SOD、GSH、CAT的含量,清除有害自由基,显示了较好的抗氧化活性;同时减轻了高脂饲料诱导建立的小鼠NAFLD模型中肝组织的病变程度,因此CSCP对NFALD具有较好的修复作用。