【摘 要】
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跟哺乳动物一样,硬骨鱼类也具有完整的补体系统。此外,不同于哺乳动物具有吞噬活性的B1细胞和执行适应性体液免疫的B2细胞,硬骨鱼类的B细胞同时具有吞噬活性和适应性体液免疫功能。虹鳟中的研究表明,补体活化分子能够显著促进头肾白细胞的吞噬活性,那么,补体活化分子能否促进硬骨鱼类B细胞的吞噬活性?其可能的分子机制是什么?为了阐明此科学问题,本研究以草鱼为实验对象展开了科学研究,主要发现如下:1)草鱼存在9
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跟哺乳动物一样,硬骨鱼类也具有完整的补体系统。此外,不同于哺乳动物具有吞噬活性的B1细胞和执行适应性体液免疫的B2细胞,硬骨鱼类的B细胞同时具有吞噬活性和适应性体液免疫功能。虹鳟中的研究表明,补体活化分子能够显著促进头肾白细胞的吞噬活性,那么,补体活化分子能否促进硬骨鱼类B细胞的吞噬活性?其可能的分子机制是什么?为了阐明此科学问题,本研究以草鱼为实验对象展开了科学研究,主要发现如下:1)草鱼存在9个补体C3分子,其中C3.1是9个C3分子中表达量最高的分子;2)补体系统活化后C3.1能被切割产生C3a.1分子;3)C3a.1能够显著促进Ig M+B细胞的吞噬活性;4)C3a.1通过C3a R促进了Ig M+B细胞的吞噬活性。具体研究结果如下:1.草鱼C3.1是9个C3中表达量最高的分子通过同源搜索,我们在草鱼基因组中发现了9个C3基因,将其分别命名为C3.1-C3.9。基因组共线性分析表明,草鱼9个C3基因位于三个不同染色体（Chr）上,C3.1-C3.6位于Chr 1,C3.7位于Chr 10,而C3.8-C3.9位于Chr 3,其中C3.1-C3.6与四足动物中的C3基因具有更保守的基因组共线性。荧光定量PCR检测显示,草鱼C3基因在肝脏中的m RNA表达量显著高于其他组织,且C3.1是肝脏中m RNA表达量最高的基因。进一步,液相色谱串联质谱检测显示,草鱼C3.1是草鱼血清中含量最高的C3分子。因此,C3.1应是草鱼C3中的主效分子。2.补体系统活化后C3.1能被切割产生C3a.1分子通过多序列比对及对C3转化酶切割位点的分析,我们确定了草鱼C3活化后会产生的C3a分子,基于C3a分子的C末端序列我们用多肽制备了兔抗草鱼C3a.1的多克隆抗体。用兔红细胞活化草鱼血清并用凝胶过滤色谱分离后,Western blot检测到了天然C3a.1的产生。3.C3a.1能够显著促进Ig M+B细胞的吞噬活性我们原核表达并纯化了GST-C3a.1融合蛋白。研究发现GST-C3a.1显著促进了草鱼头肾Ig M+B细胞的吞噬活性（17-28%）。同源建模显示草鱼C3a.1由四个α-螺旋组成,其C端形成了一个长的α-螺旋。进一步研究发现,C3a.1的C端α-螺旋区多肽也可显著促进Ig M+B细胞的吞噬活性（32-55%）,表明此区域为C3a.1的功能区。4.C3a.1通过C3a R促进了Ig M+B细胞的吞噬活性荧光定量PCR检测显示,草鱼C3a R基因在Ig M+B细胞中的m RNA表达量显著高于其他白细胞。此外,双色免疫荧光显示,C3a R定位到Ig M+B细胞的细胞膜上。进一步研究发现,C3a.1的促Ig M+B细胞吞噬活性可被抗C3a R抗体显著抑制,表明C3a.1通过Ig M+B细胞上的特异受体C3a R发挥了促吞噬作用。总之,我们的研究不仅揭示了硬骨鱼类C3a的新功能,即促B细胞吞噬活性,而且增加了我们对硬骨鱼类补体系统和吞噬B细胞之间相互作用的认识,且为C3a作为靶向吞噬B细胞的分子佐剂的研究奠定了一定的理论基础。
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