【摘 要】
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草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国养殖规模最大的淡水鱼类品种,但草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）引起的出血性疾病严重影响草鱼养殖业的发展,而其发病机制仍不清楚。II型GCRV作为目前的主要流行类型,其基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。细胞热休克蛋白90（Hsp90）在多种病毒生命周期的多个阶段发挥作用。在本研究中,我们证明过表达VP3
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草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国养殖规模最大的淡水鱼类品种,但草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）引起的出血性疾病严重影响草鱼养殖业的发展,而其发病机制仍不清楚。II型GCRV作为目前的主要流行类型,其基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。细胞热休克蛋白90（Hsp90）在多种病毒生命周期的多个阶段发挥作用。在本研究中,我们证明过表达VP35促进GCRV-Ⅱ增殖,且VP35可与Hsp90互作。Hsp90活性对GCRV-Ⅱ增殖至关重要,一方面Hsp90定位于细胞膜上,作为GCRV-Ⅱ VP35蛋白的受体,在病毒粘附与入侵过程中发挥功能;另一方面Hsp90定位于细胞质中,作为VP35伴侣蛋白,抑制Hsp90活性使VP35通过蛋白酶体途径降解。本文主要研究结果如下:1.VP35促进GCRV-Ⅱ增殖为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用,扩增S11基因并插入载体p CMV-3×Flag-14中,构建p Flag-VP35真核表达质粒,转染草鱼肾细胞（CIK）后感染GCRV-Ⅱ,收集感染后的上清液与细胞。利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中GCRV-Ⅱ S6基因的m RNA,结果显示过表达VP35在病毒m RNA水平促进病毒增殖;扩增S6基因并插入到载体p ET32a（+）中,构建重组原核表达质粒,纯化VP4蛋白（另一外衣壳蛋白）并制备多克隆抗体,Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白,结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进病毒增殖;使用p ET32a-VP4质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线,建立GCRV-Ⅱ病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法,利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒,结果表明过表达VP35增加病毒拷贝数。从三个维度证明过表达VP35促进GCRV-Ⅱ增殖。2.Hsp90可与VP35互作且Hsp90促进GCRV-Ⅱ增殖进一步鉴定与病毒外衣壳蛋白VP35互作的宿主蛋白,Co-IP筛选后经SDS-PAGE分离并银染,进行质谱分析,其中Hsp90是潜在互作蛋白之一。Co-IP实验表明Hsp90与VP35互作,亚细胞定位实验表明Hsp90与VP35在细胞中共定位。纯化His-Hsp90重组蛋白,通过His-Pull down实验进一步证实Hsp90与VP35的直接互作。si RNA敲降Hsp90后显著抑制GCRV-Ⅱ增殖,使用17-DMAG和Geldanamycin抑制Hsp90的活性后也可显著抑制病毒增殖,表明Hsp90在GCRV-Ⅱ增殖过程中发挥重要功能,可起到促进病毒增殖的作用。3.Hsp90作为VP35的受体及伴侣蛋白从而促进GCRV-Ⅱ增殖病毒感染周期的初始步骤即病毒外衣壳蛋白与细胞表面表达的受体蛋白特异性结合,为探究Hsp90在GCRV-Ⅱ入侵宿主细胞时的功能,间接免疫荧光技术观察非透化CIK细胞,细胞膜呈有分支的细长三角形,即CIK细胞形态,细胞膜上存在点状分布的Hsp90;流式细胞术准确定量其分布情况,结果表明有9.24%的细胞显示阳性信号,证明Hsp90不仅定位于CIK细胞质中,也定位于CIK细胞膜上。17-DMAG抑制Hsp90后显著减少GCRV-Ⅱ吸附与进入CIK细胞,证明Hsp90活性对于GCRV-Ⅱ入侵CIK细胞至关重要。Hsp90抗体阻断CIK细胞表面定位的Hsp90或用His-Hsp90融合蛋白预处理GCRV-Ⅱ,病毒与CIK细胞的结合被抑制,而过表达Hsp90则会促进病毒进入,表明Hsp90是GCRV-Ⅱ VP35蛋白的受体。抑制Hsp90活性后显著减弱VP35的表达,表明Hsp90作为VP35的伴侣蛋白,抑制其活性使得VP35通过蛋白酶体途径降解。本研究证实Hsp90作为GCRV-Ⅱ受体,在病毒增殖过程中发挥作用,为进一步探究GCRV-Ⅱ的致病机制提供理论基础,也为应对病毒感染提供新的抗病毒策略。
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