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研究目的:研究缺氧后胰腺癌细胞的干性变化以及在此过程中释放的外泌体(Exosome)对血管生成(Angiogenesis)的影响,从而发现缺氧微环境对胰腺癌肿瘤细胞以及其干性发展的重要作用,进而了解胰腺癌干细胞发生、发展背后的机制和其通过外泌体途径与肿瘤微环境之间的信息交流,对于揭示临床胰腺癌的侵袭与转移行为具有指导意义,为胰腺癌的肿瘤干性耐药治疗、分子治疗提供理论依据。研究方法:(1)采用CCK-8法检测了胰腺癌肿瘤细胞在常氧、缺氧条件下的增殖率,以及胰腺癌细胞在缺氧以及吉西他滨作用下的增殖率的变化情况。(2)采用流式检测细胞技术(Flow Cytometer,FCM)及流式细胞术间接免疫荧光标记(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS)检测胰腺癌细胞株中CD133干性标记分子的表达情况。流式检测细胞术检测常氧、缺氧条件下胰腺癌细胞系PANC-1和AsPC-1的干性标记分子CD133的表达情况;使用流式细胞术间接免疫荧光标记法(FACS)分选出胰腺癌PANC-1细胞株,并且检测了常氧、缺氧条件下胰腺癌PANC-1细胞CD133~+亚群的比例。(3)采用Western-blot检测分选出的胰腺癌CD133~+细胞亚群在不同缺氧时间后CD133干性标记分子的表达情况。(4)采用超速离心法(Ultracentrifugation)分离和纯化常氧、缺氧条件下胰腺癌PANC-1细胞分泌的外泌体。(5)采用透射电子显微镜(Transmission Electronic Microscope,TEM)、动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)、western-blot表征常氧、缺氧条件下分离得到的外泌体。(6)采用小管形成实验(Tube Formation Assay)和血管出芽实验(Sprouting Assay)检测缺氧条件下胰腺癌PANC-1细胞分泌的外泌体对血管生成的影响。研究结果:(1)CCK-8检测结果显示,胰腺癌细胞株PaTu 8988t、BxPC-3、PANC-1、AsPC-1和SW1990在缺氧条件下的增殖率明显下降;缺氧条件下胰腺癌细胞系的化疗抵抗明显增强,同时细胞的凋亡率减低。(2)流式检测细胞术结果显示,缺氧条件下胰腺癌PANC-1和AsPC-1细胞中,CD133~+细胞的比例明显上升,同时PANC-1细胞中CD133~+的比例较高。(3)Western-blot结果显示,随着缺氧时间的延长,胰腺癌PANC-1细胞中干性标记分子CD133~+的蛋白表达量随缺氧时间的延长明显上升,Nanog变化则不是十分明显。(4)动态光散射结果表明,与常氧条件相比,缺氧条件下从PANC-1细胞中分离的外泌体粒径增大,蛋白含量增多。(5)小管形成实验及血管出芽实验表明,缺氧下的胰腺癌细胞分泌的外泌体对血管生成的作用明显增强,缺氧条件下的胰腺癌CD133~+细胞释放的外泌体对血管生成似乎有更强的促进作用。结论:(1)缺氧条件下胰腺癌细胞的耐药性提高、干性增强,干性细胞比例升高。(2)缺氧诱导胰腺癌细胞分泌的外泌体粒径增大,蛋白分泌分泌量增多。(3)缺氧诱导胰腺癌干细胞通过外泌体途径分泌的外泌体促进血管生成,从而促进了胰腺癌的侵袭和转移。为揭示临床胰腺癌的早期侵袭和转移提供了新的线索和理论基础。