新城疫（ND）和鸡传染性支气管炎（IB）是世界动物卫生组织规定须通报的动物传染病和我国农业部规定的分别为一类和二类的动物疫病,疫病的流行会造成生产性能的降低和鸡群死亡等严重后果,直接造成巨额的经济损失,已俨然成为制约水禽养殖的重大威胁。然而发展到目前为止,对于这两类疫病最高效经济的防控方式无疑是使用疫苗免疫;传统疫苗的种类主要包括:灭活疫苗和减毒的活疫苗,但是面对像IB这种血清型众多的病毒株,传统疫苗的保护就显得有些力不从心,况且传统疫苗病毒株稳定性差,常出现毒力返强现象,生产成本高、制备工艺复杂、免疫程序繁琐也导致了商品化疫苗的水平参差不齐;诸多问题的叠加放大加快了新型疫苗的研究脚步,基因工程疫苗首当其冲,逐步成为了疫苗研究中的新宠。能够同时表达多个与目标抗原相关及辅助性表位的疫苗被称为鸡尾酒式疫苗,也就是多表位疫苗。作为基因工程疫苗研究领域的翘楚,它能够被多种遗传背景的MHC分子特异性识别结合,诱导高效的递呈反应,增强免疫应答反应,在应对病原微生物的基因突变方面及克服免疫反应中的不良因素中具有得天独厚的优势。此次研究所用本团队已构建完成的重组新城疫病毒表达传染性支气管炎病毒的多表位疫苗rNDV-IBV-T/B株,它是以NDV的La Sota株作为载体,首先将NDV-TS09-C株的耐热性HN基因替换至La Sota株,增强了其热稳定性,然后应用基因工程技术,将IBV-S1蛋白的T、B淋巴细胞功能性表位插入到NDV的F和M基因之间,并通过反向遗传技术将重组病毒进行体外拯救,获得了重组病毒rNDV-IBV-T/B株,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够有效抵抗新城疫病毒以及多种亚型IBV感染。作为转基因微生物,基因安全问题一直以来是基因工程疫苗研究中所面临的重点,为防止对周围环境及人造成不必要的损害,《农业部转基因生物安全管理条例》对转基因生物的生产应用也做出了明确的规定,一般在通过小规模的中间实验、中规模的环境释放实验、大规模的生产性实验三个阶段,经验收合格后方能获得转基因生物安全证书并开展下一阶段的研究,作为基因工程疫苗在生产应用中必须要经历且重要的一环。为此,本研究针对重组病毒rNDV-IBV-T/B株安全性进行评估,为疫苗的生产应用提供了数据支持和保证,同时大力推动了基因工程疫苗的发展进程。本研究对构建保存的重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因表达及遗传稳定性进行了分析。利用鸡胚传代的方法将重组病毒不断复制扩增,在传代25次后收取鸡胚尿囊液,对重组病毒进行RT-PCR检测并送检测序分析基因突变情况;同时,针对重组病毒外源性插入基因进行特异性检测以及灵敏性分析。结果表明,当重组病毒利用鸡胚传代若干代后无基因突变现象且能够扩增出两条大小为1592bp和977bp的特异性条带,初步说明了重组病毒具有良好的遗传稳定性。当重组病毒的c DNA模板稀释度至10-4时仍能扩增出两条特异性条带,用其他病毒配合特异性引物进行PCR扩增无任何目的条带,重组病毒rNDV-IBV-T/B株能够扩增出两条目的条带,母本La sota株能得到一条目的条带,利用鸡胚还检测出重组病毒具有高水平病毒滴度。这些结果说明重组病毒在多次传代仍具有较强复制能力与毒力水平,插入基因稳定表达且特异。对1日龄的雏鸡进行滴鼻点眼免疫接种,免疫剂量大小为106EID50/0.2m L,在免疫后每日观察鸡群的精神状态及发病死亡情况,免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天进行剖检观察,并取鸡只组织脏器及环境中的饮水、饲料等进行RT-PCR检测。结果发现在整个实验进程中未发生鸡只死亡情况,鸡群采食及精神状态良好,鸡只组织脏器剖检观察均正常,RT-PCR结果显示,在整个免疫观察期内未在免疫鸡体内各脏器中及周围环境饮水、饲料中检测到重组病毒rNDV-IBV-T/B株目的基因;为进一步检测证实PCR结果的可靠性,对重组病毒rNDV-IBV-T/B的安全性进行进一步评估,我们利用间接免疫荧光技术（IFA）,通过细胞水平的检测重新划定重组病毒在机体及环境中的留存情况。在免疫后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天取靶动物鸡的组织器官和周围环境中饮水、饲料等处理后去感染Hela细胞,同时也用重组病毒rNDV-IBV-T/B和NDV强毒Herts33感染Hela细胞作为两个阳性对照。经过检测我们可以发现,在免疫后的56d内,组织脏器及周围环境样品中没有检测到绿色荧光信号,阳性组有明亮的绿色荧光信号标记,即在组织和周围环境中没有检测到重组病毒,说明了重组病毒对靶动物鸡和环境是安全的。综上所述,本实验对表位疫苗株rNDV-IBV-T/B安全性进行了客观性评价,证实了其安全性,为推动疫苗发展进程提供了数据支撑。