研究背景冠状动脉支架植入术是目前治疗冠心病的主要方法,它显著降低了急、慢性冠状动脉事件的发生率和死亡率,但支架置入仍面临再狭窄的问题。虽然药物洗脱支架可使6个月内的再狭窄发生率降到5%,但对于一些冠脉复杂病变和存在高危因素的患者其再狭窄发生率仍高达10%～50%[1]。PCI与CABG对多支冠脉病变患者的远期安全性和疗效比较:ARTS、ERACI-II、MASS-II和SoS试验5年荟萃分析,虽然提示PCI和CABG的远期安全性相近,但同时也指出CABG组需要再次介入治疗的患者比例较低,术后5年CABG组总体的主要不良心脏事件和心血管事件的发生率显著低于PCI组[2],这也从侧面说明了降低患者再次PCI具有重要意义。研究证实,血栓、炎症及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖是引起的血管重建,造成血管再狭窄的3个重要方面,其中VSMC的增殖是触发整个血管内膜增生的始动因素[3]。如何预防和阻止VSMC的异常增殖,对防治血管成形术后再狭窄改善患者的预后具有重要意义。AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是一个异源三聚体,在体内葡萄糖缺乏、缺氧、缺血及热休克等引起AMP/ATP比率升高的情况下均能引起细胞内AMPK的激活[4],激活的AMPK除在能量代谢方面起重要的调节作用,还在基因水平参与细胞内转录调节,影响细胞分裂周期[5],引起VSMC的分裂增殖周期停滞从而抑制其增殖[6]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,mTOR在细胞生长、增殖及分化中具有重要的调节作用[7]。mTOR诱导密码子翻译起始[8],影响细胞DNA复制、分裂周期的G1/S/G2转变。Kimura等[9]的研究认为激活的AMPK可以抑制由生长因子和氨基酸刺激激活的mTOR信号途径,也有研究指出AMPK可以通过抑制翻译延伸因子(EF2)减少蛋白质的合成[10]。AMPK的这种作用为防治血管平滑肌细胞增殖性疾病提供了一个新的方向,本研究通过观测激活的AMPK对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)表达及活性的影响,进一步探讨和认识影响VSMC增殖的作用途径。研究目的和内容用体外组织块细胞培养方法,培养并鉴定SD大鼠胸主动脉VSMC。观察在血清培养条件及PDGF-bb刺激因子作用下,激活的AMPK对SD大鼠VSMC增殖的影响,通过检测激活的AMPK对VSMC的mTOR表达和活性的影响,进一步探讨AMPK对血管平滑肌细胞增殖的影响,为防治非正常途径下VSMC的增殖提供新的线索和理论依据。研究方法1.SD大鼠胸主动脉VSMC培养SD雄性大鼠购自广东实验动物中心(粤监证字2008A002),质量200～300g,戊巴比妥麻醉后,无菌状态取出胸主动脉,采用组织块贴壁培养法,传代筛选后用α-actin平滑肌细胞检测试剂盒鉴定细胞。0.25%的胰酶消化传代。采用4～6代细胞进行实验。2.SD大鼠VSMC细胞生长曲线绘制取4～6代细胞,观察并计数VSMC的生长,绘制细胞生长曲线,找出细胞的对数生长期,从而确定药物干预时间。3.Western blot检测AMPK在VSMC的激活取第4代VSMC,经AICAR干预后,分别在时间点30min、1h、3h、6h、12h、24h抽提细胞总蛋白,用Western blot检测AMPK在VSMC的激活。4.不同浓度AICAR在不同时间点对VSMC的增殖的影响采用MTT法检测不同干预浓度的AICAR在24h、48h、72h对细胞增殖的影响,酶标仪在570nm处记录OD值,每组6个复孔。5.半定量RT-PCR检测AICAR干预后细胞mTOR的mRNA的表达取第4代VSMC,分别经不同浓度AICAR干预后,用半定量RT-PCR方法,检测VSMC的mTOR在mRNA水平表达的变化。6.Western blot检测AICAR干预后细胞mTOR磷酸化水平的改变取第4代VSMC,经相同浓度AICAR干预后,用Western blot检测不同时间点mTOR活性(p-mTOR)的改变。7.统计学分析计量资料以均数±标准差(x±s)表示,统计方法用SPSS l3.0 for Windows软件包进行统计分析,多组之间比较采用方差分析,两组之间的比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1. VSMC的培养及鉴定采用组织块贴壁培养法,组织贴块从第3天开始有细胞从组织块边缘爬出,从第4天开始由组织块爬出细胞逐渐增多,到第14天左右爬出的细胞逐渐铺满组织块周围的显微镜视野。传代培养到第4代细胞,细胞呈现血管平滑肌细胞典型的“峰-谷”样,“沟、壑”样生长的形态。经免疫组化染色后,高倍镜下可见胞浆内阳性着色的丝状α-actin分布,鉴定为VSMC且VSMC的纯度>99%。2. VSMC生长曲线的绘制取第4代VSMC,采用细胞计数法,绘制VSMC生长曲线显示:从接种细胞0～5.5天,曲线呈“S”形,细胞在2～4.5天处于生长旺盛的增殖期,可排除来自细胞本身等影响因素对细胞增殖的影响,这段时间药物干预具有实际意义。3.不同浓度AICAR在不同时间点对VSMC的增殖的影响采用MTT法检测不同干预浓度的AICAR在24h、48h、72h时均可显著抑制两种条件(血清培养条件及PDGF-bb刺激因子)下细胞增殖,呈一定的剂量依赖性,各组增殖数据差异具有统计学意义。4. AICAR干预后细胞在不同时间点检测p-AMPK的激活p-AMPK和β-actin条带都出现在相应的分子量位置。采用Quantity One图像分析软件分析整理数据后显示,0.5 mmol/L AICAR干预30min时AMPK开始激活,到6h时其激活程度达到最大,以后逐渐减弱,表明AICAR对AMPK的激活随时间逐渐增强后又逐渐减弱。5.不同浓度的AICAR对细胞mTOR的mRNA的表达的影响从PCR电泳图像上,可以看到mTOR和GAPDH条带都出现在相应的分子量位置。采用Quantity One软件分析图像,数据显示,在24h时mTOR的mRNA的表达随AICAR干预浓度增加其扩增量逐渐减少,各浓度组的灰度比值,差异具有统计学意义(P<0.01)。6. AICAR对细胞内mTOR磷酸化的影响western blot图像显示p-mTOR和β-actin条带都出现在相应的分子量位置。分析Western blot结果发现:0.5mmol/L的AICAR可以显著抑制p-mTOR的表达,并存在时间依赖性。AICAR干预后,从10min开始p-mTOR表达逐渐被抑制,在12h时p-mTOR表达几乎完全被抑制,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1.本研究显示,AICAR可以激活血管平滑肌细胞中AMPK,且在有AICAR干预下,可以显著抑制血清培养条件和PDGF-bb刺激因子作用下血管平滑肌细胞的增殖。2.本研究显示,在SD大鼠血管平滑肌细胞中,AICAR激活的AMPK可以显著抑制细胞内mTOR的mRNA表达,并显著抑制p-mTOR的活性。3.我们认为激活的AMPK可能通过mTOR途径,抑制血管平滑肌细胞的增殖。