肿瘤晚期患者的治愈率极低,因此提高早期肿瘤患者的检出率成为肿瘤治疗的关键。开发基于肿瘤标志物的检测试剂盒是肿瘤早期诊断的主要途径之一,目前已经发现的肿瘤标志物多达100多种,已用于临床诊断的约有20种[1],但是由于肿瘤的异质性及个体差异等原因,单纯利用一种标志物检测的准确性不是很高,灵敏度和特异性也普遍偏低,开发基于新的肿瘤标志物的检测试剂盒,将大大提高检测的灵敏度及准确性。REGγ,属于11s蛋白酶体激活因子家族成员[2],又被称为PA28γ,PSME3,K i抗原[3],可以与20s蛋白酶体结合介导蛋白质的降解[4],与普遍存在的泛素化降解蛋白途径不同的是,REGγ介导的是非泛素化,非ATP依赖的蛋白质的降解,参与了生命体内许多重要的生命过程。包括癌症的发生,自我免疫,细胞凋亡,代谢衰老及多功能干细胞的发育等[3]。研究工作表明REGγ在结直肠癌、乳腺癌和甲状腺癌等多种肿瘤病人的血清中过度表达[2]。因此本研究的目的是初步开发和评估一种可灵敏检测血清中REGγ的夹心ELISA试剂盒,期望用于结直肠癌患者及其他相关癌症的早期诊断。方法:以纯化得到的单克隆抗体作为包被抗体;纯化的REGγ、GST-REGγ、His-REGγ作为蛋白抗原;公司制备的多克隆抗体作为检测抗体,分别以100μl每孔加入到96孔酶标板,进行大容量反应体系夹心ELISA法的试验;后期为了提高试剂盒的灵敏度,我们在原有基础上引入了生物素-链霉亲和素（BAS）系统,优化相关理化因素,确定最佳试验条件,建立合适的标准曲线;最后,通过特异性检验、重复性检验,对建立的夹心ELISA方法进行性能评估。结果:通过亲和层析、过分子筛凝胶过滤层析、浓缩等方法得到质量浓度约为1mg/ml的不同标签的抗原蛋白;通过杂交瘤细胞上清纯化、浓缩定量的方法得到浓度约为1mg/ml单克隆抗体,用于包被;公司制备的多克隆抗体浓度约为3.2mg/ml,用于检测;通过间接ELISA实验确定了单克隆抗体的最佳稀释比为1:2000,多克隆抗体的最佳稀释比为1:4000;通过实验分析与比较,确定了单克隆抗体包被,多克隆抗体检测的组合方式和四参数方程拟合回归曲线;加入生物素-链霉亲和素系统之前,夹心ELISA法对REGγ检出的最低浓度大概为3ng/ml,在优化条件下后,加入BAS系统,夹心ELISA法对REGγ检出的最低浓度可以达到375pg/ml,,比常规容量反应体系灵敏度提高了约10倍;通过比较不同的封闭条件确定了3%的脱脂牛奶为最佳封闭试剂;通过细胞裂解液和模拟人体血清环境对此方法进行特异性检验发现细胞裂解液暂时无法用此试剂盒检测,血清检测结果表明此方法特异性强,与血清中其他蛋白无交叉反应;重复性试验显示,板间变异系数为1.22%—6.22%,板内变异系数为0.88%—5.04%,均小于7%,说明该方法稳定性好。后期研究可能还会引入新的技术手段用来提高灵敏度,灵敏度达到预期后,我们就可以用患者血清对试剂盒进行测试。本课题初步开发出一种新型ELISA试剂盒,期望为肿瘤的早期诊断提供更多选择,进而提升肿瘤早期诊断的灵敏度和特异性。