膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率一直呈升高趋势。手术和术后化疗是治疗膀胱癌的主要手段。尽管膀胱癌的治疗在手术技术及化疗药物方面有了一些进步,但由于膀胱癌具有易复发、易侵袭和易转移等生物学特点,其整体的治疗效果并没有显著的改善。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类环形的非编码RNA,过去曾被认为是基因转录剪接中发生错误的“副产品”。随着高通量测序和生物信息学技术的快速进展,目前研究发现多种动、植物细胞内存在数千种稳定高表达的circRNA,大多数定位于细胞浆中,具有细胞、组织、发育阶段、疾病相关等表达特异性,并且对基因表达发挥着重要的调控作用。为了研究circRNA在膀胱癌组织中的表达以及对膀胱癌细胞生物学行为的影响,我们通过膀胱癌及正常膀胱组织高通量测序、组织及细胞验证,选取膀胱癌相关环状RNA-2(bladder cancer related circular RNA-2,BCRC-2)作为研究对象,并通过体内外实验进一步研究BCRC-2对膀胱癌细胞生物学行为影响,并以circRNA可作为“microRNA(miRNA)分子海绵”为切入点,研究BCRC-2的作用机制。本课题分为以下三个部分:第一部分人膀胱癌组织中环状RNA的表达及膀胱癌相关环状RNA-2(BCRC-2)在膀胱组织及细胞中的表达研究目的:检测人膀胱癌组织和正常膀胱组织中环状RNA(circRNA)的表达情况,随后选择表达差异明显的circRNA进一步研究。方法:首先对人膀胱癌组织及配对的正常膀胱组织进行环状RNA高通量测序,通过生物信息学分析,选取在膀胱癌组织和正常膀胱组织中表达差异明显的circRNA进行下一步研究。然后,设计针对特定circRNA的正向及反向引物,通过逆转录PCR(RT-PCR)确认其在膀胱癌组织及细胞中的存在,并且通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测其在膀胱癌组织和细胞中的表达情况,验证是否与测序分析结果相一致。最后,通过RNA荧光原位杂交技术(FISH)了解circRNA在细胞内的定位。结果:1.通过对3对人膀胱癌组织及配对的正常膀胱组织进行circRNA高通量测序,共检测出16,535个circRNA,大部分来源于外显子(88.9%),其他来源包括内含子、lincRNA、基因间隔区(intergenicregion)、3’UTR 和 5’UTR等。2.在检测出的circRNA中,共有571个circRNA在膀胱癌组织和正常膀胱组织表达差异较为明显,其中有524个circRNA在膀胱癌组织中表达明显下降(91.2%),有47个circRNA在膀胱癌组织中表达升高。3.通过RT-PCR证实了膀胱癌相关环状RNA-2(BCRC-2)在膀胱癌组织和细胞中的存在,并且用qRT-PCR定量检测了 BCRC-2在44对膀胱癌组织及正常膀胱组织的表达,发现与正常膀胱组织相比,BCRC-2在膀胱癌组织中明显低表达(35/44,79.5%),并且在高病理分期(31/33)、分级(28/31),发生淋巴结转移(16/17)及血管侵袭(15/15)的患者中,BCRC-2的下降水平尤为明显;以永生化尿路上皮细胞SV-HUC-1细胞为对照,BCRC-2在膀胱癌细胞系T24T和UMUC3中表达亦明显下降(P<0.01)。4.对比RNaseR消化前后的BCRC-2和其线性HIPK3 mRNA的表达水平,发现用RNase R消化后BCRC-2表达水平与未消化组相比无明显变化,而RNaseR消化后,HIPK3mRNA表达水平明显下降(P<0.01)。5.通过RNA荧光原位杂交发现BCRC-2主要定位在膀胱癌细胞的细胞浆中。结论:膀胱癌组织中存在有大量的circRNA,大部分为外显子来源,与正常组织相比表达明显下降。BCRC-2主要定位在膀胱癌细胞的细胞浆,其在膀胱癌组织和细胞中的表达均明显下调,且与患者的病理分期、分级、淋巴转移和血管侵袭密切相关,提示BCRC-2可能在膀胱癌发生发展过程发挥重要的调控作用。第二部分膀胱癌相关环状RNA-2(BCRC-2)对膀胱癌细胞生物学行为影响的体内外实验目的:研究BCRC-2对膀胱癌细胞生物学行为的影响。方法:1.构建BCRC-2过表达质粒,将其转染T24T和UMUC3膀胱癌细胞系,通过qRT-PCR定量检测转染后BCRC-2升高水平,以证实过表达质粒的有效性;2.建立T24T和UMUC3过表达BCRC-2的稳筛细胞系,通过细胞划痕、Transwell细胞侵袭、迁移等实验,检测过表达BCRC-2后,T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移能力发生的变化;3.构建针对BCRC-2的小干扰RNA(siRNA),将T24T及UMUC3细胞中的BCRC-2敲低后,再通过细胞划痕、Transwell细胞侵袭、迁移等实验,检测T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移能力的变化;4.通过qRT-PCR和Western blot,分析过表达或干扰BCRC-2后,T24T和UMUC3细胞中,金属基质蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平变化;5.建立裸鼠膀胱癌皮下移植瘤和肺转移瘤模型,分析过表达BCRC-2后,是否能对裸鼠皮下移植瘤及肺转移瘤产生影响。结果:1.转染BCRC-2过表达质粒后,与转染空质粒组(vector)相比,T24T(升高 113.8±12.87 倍)和 UMUC3(升高 195.6± 14.77 倍)细胞中 BCRC-2 的表达水平均有不同程度的明显升高;2.与转染vector组细胞株相比,过表达BCRC-2后,T24T和UMUC3细胞的侵袭、迁移能力明显下降;反之将T24T和UMUC3细胞中的BCRC-2敲低后,膀胱癌细胞的侵袭、迁移能力增加;3.过表达BCRC-2后,与vector组相比,T24T和UMUC3细胞中MMP-9和VEGFmRNA及蛋白表达均明显下降,而敲低BCRC-2后,它们的表达增加;5.裸鼠皮下移植瘤和肺转移瘤模型显示,过表达BCRC-2可明显抑制膀胱癌细胞的生长和肺转移。结论:过表达BCRC-2可明显抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移能力,其在膀胱癌的发展过程中起重要作用。第三部分膀胱癌相关环状RNA-2(BCRC-2)通过调控miR-558影响膀胱癌细胞生物学行为的机制研究目的:探索BCRC-2调控膀胱癌细胞侵袭、迁移能力的作用机制。方法:1.通过交叉比对miRanda、PITA和RNAhybrid数据库,预测可与BCRC-2结合的microRNA(miRNA);2.设计针对BCRC-2环化结合区序列的生物素标记探针,并用RNA pulldown证实探针可特异性结合BCRC-2,并用qRT-PCR检测T24T和UMUC3细胞中与BCRC-2结合的miRNA表达水平;3.通过RNA FISH共定位BCRC-2和miRNA,证实二者的结合;4.通过qRT-PCR检测miRNA在膀胱癌组织及细胞中的表达情况,并构建miRNA mimics和inhibitor,分别转染后,通过细胞划痕、Transwell侵袭、迁移和血管形成实验,研究miRNA对膀胱癌细胞侵袭、迁移和血管形成的影响;5.通过qRT-PCR和western blot研究miRNA对靶基因的影响;6.共转染BCRC-2和miRNA mimics,通过 qRT-PCR、western blot、细胞划痕、Transwell 侵袭、迁移和血管形成实验,研究BCRC-2和miRNA对膀胱癌细胞侵袭、迁移和血管形成能力的影响。结果:1.通过数据库比对预测了 12个可与BCRC-2结合的miRNA;2.生物素标记的BCRC-2 pulldown探针可特异性结合BCRC-2;3.在T24T和UMUC3细胞中,BCRC-2可与miR-558结合,并且RNA FISH证实二者共定位在癌细胞的细胞浆中;4.miR-558在膀胱癌组织中的表达要明显高于正常膀胱组织,同样地其在T24T和UMUC3细胞中的表达也要高于SV-HUC-1细胞;5.转染miR-558 mimics后可增加T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移和血管形成的能力,并可增加乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)及其下游MMP-9和VEGF的表达水平,反之,转染miR-558 inhibitor则抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移和血管形成,并且降低HPSE、MMP-9和VEGF的表达;6.BCRC-2可逆转miR-558对T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移和血管形成的促进作用。结论:BCRC-2可吸附结合miR-558,减弱miR-558对靶基因HPSE及其下游MMP-9和VEGF的促进作用,最终抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移和血管形成能力。