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苔藓植物在进化上介于藻类植物和蕨类植物之间,分为苔纲、藓纲和角苔纲。苔类植物是活性天然产物的宝库,富含萜类和芳香类化合物,其代谢产物具有多样的生物活性,如抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等。由于苔类植物生长环境特殊,其个体矮小且往往种间杂生,较难富集到足够的生物量用于研究。因此,分子生物学和代谢工程技术可能成为解决该问题的有效途径。地钱（Marchantia polymorpha）是苔类植物的模式植物,已经对其进行了全基因组测序,为深入研究地钱的次生代谢通路提供了便捷途径。双联苄类化合物是苔类植物的典型成分和重要的活性物质。前人通过同位素追踪法推测苔类植物的联苄类化合物来自苯丙烷代谢途径:L-苯丙氨酸依次经苯丙氨酸裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H）、双键还原酶（Double bond reductase,DBR）、对羟基肉桂酰辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA ligase,4CL）的催化生成二氢对羟基肉桂酰辅酶A（dihydro-p-Coumaroyl-CoA）。随后该产物与三分子丙二酸单酰辅酶A（Malonyl-CoA）经过羧酸芪类合成酶（Stilbenecarboxylate synthase,STCS）和聚酮还原酶（Polyketide reductase,PKR）共同作用生成单联苄半月苔酸（Lunularic acid,LA）。最后在P450偶联作用下将两分子单联苄转化为双联苄类化合物。因此,研究地钱中联苄生物合成的关键酶对于阐明重要次级代谢产物的生物合成途径,通过代谢工程手段提高天然活性产物含量具有重要意义;同时地钱作为模式植物,对其功能基因的鉴定,将为研究其他苔类植物联苄的生物合成途径提供方法和思路。本文对地钱中联苄合成途径上的关键酶STCS进行研究,筛选地钱基因组数据库,找到7个注释为STCS的基因,并分别命名。将其与其他植物中鉴定得到的PKS Ⅲ基因进行进化分析,发现分为STCS1与STCS2两簇。其中,目的基因 MpSTCSa,MpSTCSb,MpSTCSc,MpSTCSd,MpSTCSf 和 MpSTCSg 与其他苔类植物STCS1基因聚为一簇,位于进化树底端;MpSTCSe与其他苔类植物的STCS2基因聚为一簇,位于蕨类植物CHS下方。将7个目的基因在大肠杆菌中异源表达,利用纯化后的重组蛋白进行体外酶活功能鉴定,结果显示以dihydro-p-coumaroyl-CoA为起始底物时,蛋白MpSTCSa-f均可催化二氢白藜芦醇（dihydro-Resveratrol）和根皮素（Ph1oretin,Phl）的生成,同时也生成了两个副产物二氢-4-香豆酰三乙酸内酯（dihydro-4-Coumaroyltriacetic acid lactone,dihydro-CTAL）和 dihydro-Bisnoryangonin（dihydro-BNY）,MpSTCSg 无催化活性。酶活结果显示这6个MpSTCS蛋白具备两种环化机制,但其催化生成的主产物不同:MpSTCSa,MpSTCSb,MpSTCSc,MpSTCSd,MpSTCSf 属于 STCS1 型,催化C2/C7醛醇环化和C6/C1克莱森环化能力相当;而MpSTCSe属于STCS2型,主要催化C6/C1克莱森环化生成黄酮类产物根皮素。此外,通过构建嵌合蛋白发现MpSTCS1的278-295位氨基酸在决定单联苄的生成以及蛋白催化环化类型方面起到重要作用。为了验证STCS和PKR共同作用是否可以生成LA,本文检索了地钱基因组数据库,筛选并克隆得到14个可能的PKR基因,并将其分别命名为MpPKR1-14。酵母双杂交实验发现MpPKR1/MpPKR2与MpSTCS1具有蛋白相互作用。将筛选出的MpPKR1/MpPKR2与MpSTCS1在烟草体内共表达,饲喂底物,发现共表达烟草体内生成了 LA。此外,转基因烟草中未检测到MpSTCS1的体外产物根皮素,证明植物体内环境不利于STCS1的C6/C1环化。随后我们将MpSTCS1,MpPKR1以及MpPKR2分别构建原核表达载体,得到重组蛋白并进行体外酶活实验。结果表明两者在体外也发生了相互作用,加入MpSTCS1和MpPKR的实验组生成了 dihydro-CTAL的还原产物。但遗憾的是,体外酶活中未检测到LA的生成。根据MpSTCS1与MpPKR的体外和体内酶活结果,我们推测MpSTCS1与MpPKR在体外酶活环境中可能缺乏体内的一种辅助蛋白,该蛋白可能提供一个通道,使得环状非芳香化中间体迅速被PKR催化,而不会自动环化形成二氢白藜芦醇。随后,我们克隆了大麻（Cannabis sativa）的大麻酸环化酶（Olivetolic acid cyclase,CsOAC）,并将其作为辅助蛋白。结果显示,MpSTCS1和CsOAC共同作用生成了 5-羟基半月苔酸（5-hydroxyl Lunularic acid,5-OH LA）。但三者的体外酶活实验中依旧没有检测到LA的生成。以上实验结果证明:PKS Ⅲ家族在不同植物中的进化过程应该与传统植物进化历程一致,高等植物的CHSs可能是由苔类植物的STCSs进化而来;STCS1蛋白的278-295位氨基酸对于蛋白的催化环化类型具有关键作用;STCS1和PKR是LA生物合成途径上的关键酶,通过二者的相互作用,我们首次实现了 LA在植物体内的生物合成;CsOAC作为辅助蛋白,可以与MpSTCS1共同作用生成5-OHLA,这也是我们首次利用地钱的STCS1基因实现了5-OHLA的生物合成。