关节软骨损伤是临床上的常见病,由于关节软骨缺乏血液循环和神经支配,其自行修复能力有限。骨软骨联合缺损常影响到关节的机械稳定性,从而增加骨性关节炎发生的危险。因此,研究开发合适的骨软骨移植替代材料具有广泛的现实意义。本研究从以下几个方面对一种新型骨软骨一体化移植修复材料进行了探索,材料的一体化设计可有效解决移植物的软骨与骨部分的整合问题,同时材料的分层结构又分别适合相应的软骨或骨组织的生长分化。1.胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复体的孔隙结构和细胞相容性研究目的:对胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复体作为组织工程支架材料的孔隙结构和细胞相容性进行检测和评估。方法:以胶原、壳聚糖、纳米TCP为基本材料,通过无毒交联和冷冻干燥方法制备胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复体。以体积法测定支架材料的孔隙率,扫描电镜观察材料的孔隙结构及孔径大小。原代培养兔骨髓基质干细胞(MSC),传至第二代后以3.0×10~5个/ml的细胞浓度接种于材料,MTT法于接种后2、4、6、9、12d测细胞在材料上的生长曲线。2w后扫描电镜观察细胞在材料上的粘附情况。结果:通过体积法测定材料的孔隙率为95%,SEM可以观察到支架材料具有疏松多孔结构,孔隙结构规则,孔径100～150μm,材料内部孔与孔之间贯通良好;纳米TCP被包裹在修复体表面,两者结合紧密,颗粒分布较为均匀。MSC在材料上增殖迅速,细胞基本呈现对数生长趋势。SEM显示MSC在材料上经三维培养14d后生长状态良好,细胞成片地粘附于支架表面及孔隙侧壁,并可见细胞间通过突起相互连接成片。结论:胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复材料具有良好的孔隙结构和孔隙率,细胞在材料上能够很好的粘附和生长,并且增殖迅速,有望成为一种新型组织工程支架材料。2.胶原/聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复体的体外三维软骨诱导和异位成软骨实验目的:探索胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复材料接种MSC后体外三维成软骨诱导的可行性。方法:2月龄日本大耳白兔8只,分别抽取其双侧颈骨平台下方骨髓,密度梯度离心法分离MSC,原代培养。待细胞传至第二代,以2×10~6个/ml的浓度接种于支架材料,24孔板内培养,随即培养液更换为含rhTGFβ1 10μg/L、地塞米松1×10~7 mol/L、VitC 50μg/L、新生牛血清100 mL /L的软骨诱导液。2w后取材料-细胞复合物切片,HE、甲苯胺兰染色观察材料内部的细胞生长情况和诱导分化情况;其余材料自体回植于兔股部肌袋。6w后取材,HE染色、甲苯胺兰染色、II型胶原免疫组化染色进一步鉴定细胞在体内的分化效果。结果: MSC在体外三维软骨诱导培养过程中增殖迅速,切片染色可见细胞呈多层覆盖于材料表面及内部孔壁,部分细胞生长成团,甲苯胺兰染色可见材料内的细胞大部分呈现阳性,支架材料部分降解,但总体结构无明显改变。经体外诱导2w后的细胞/材料复合物自体肌袋埋植6w后,可见支架材料大部分降解,软骨样组织在材料内部形成,甲苯胺兰和免疫组化染色均呈现阳性。结论:胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复材料接种MSC后可被三维诱导向软骨分化,并保持旺盛的增殖能力。经诱导2w的细胞材料复合物植入自体骨部肌袋后,能进一步向软骨方向分化。3.复合bBMP骨软骨修复材料的研制目的:将具有高效成骨、成软骨活性的牛骨形态发生蛋白(bBMP)复合入材料当中,以增强材料的生物活性。方法:称取bBMP40mg,溶于4ml 4M盐酸胍。将胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复体浸泡于bBMP溶液中,排尽材料内部气泡。将充分吸附bBMP溶液的材料打包于透析膜内,对蒸馏水透析4d,而后冷冻干燥12h,环氧乙烷消毒备用。取3块复合bBMP的材料喷金后行扫描电镜观察。取6块复合bBMP的材料以1×106个/ml的细胞浓度接种兔MSC,2w后扫描电镜观察细胞在材料上的粘附和生长情况。结果:材料复合bBMP后大体形状及孔隙结构与复合前无异,扫描电镜可以清楚观察到材料表面及孔隙内部有丝絮状bBMP薄膜,MSC在生物材料上生长迅速,黏附良好,材料的表面及孔隙内部均有大量MSC生长。结论:应用透析方法制备的生物材料保持了良好的结构,具有良好的细胞相容性,同时理论上将大大提高材料的生物学性能。4.复合bBMP骨软骨修复材料用于兔关节骨软骨缺损修复的初步研究目的:以复合bBMP的生物活性材料修复兔关节软骨缺损,验证材料的生物活性。方法:2.5±0.2kg体重日本大耳白兔8只,在双侧股骨髁间窝处制造直4mm深达髓腔下的缺损。将8块复合bBMP的骨软骨修复材料分别植入右侧缺损作为实验组,4块不含bBMP的胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化层状修复体植入左侧缺损作为对照组1,其余4个左侧缺损旷置作为对照组2。12周后取材,大体观察及切片染色观察缺损修复情况。结果:12周后,实验组骨软骨缺损被白色透明组织覆盖,与周围软骨连接紧密,已无明显分界线;对照1骨软骨缺损内为白色纤维样组织填充,缺损轮廓依然明显;对照2缺损依然较深,中心仅少量组织填充。镜下实验侧HE染色显示透明软骨形态,甲苯胺兰染色显示新生组织软骨表型明显,软骨下骨修复良好;对照1缺损表面以纤维样组织修复,软骨下骨已经基本修复;对照2仍有较深的缺损,缺损顶部覆以纤维样组织。结论:胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复体复合bBMP后具有较强的生物活性,能在早期较好的修复骨软骨联合缺损。以上研究结果表明,胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化骨软骨层状修复材料具有良好的孔隙结构和生物相容性,适合作为骨软骨组织工程支架材料;复合bBMP后,材料具有较高的生物活性,能较好的修复骨软骨缺损。