研究背景:在世界范围内结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是发病率位于第三位,死亡率第二位的严重危害人类健康的恶性肿瘤;在我国CRC是发病率和死亡率均排第五位的恶性肿瘤,仅次于肺癌、胃癌、食管癌、肝癌,严重威胁人类的健康和生命。其高发于北京、上海、浙江等地,CRC的高发年龄为40-50岁。在CRC的治疗中,手术切除是目前最有效的治疗方法。但是,它仅适用于早期轻度CRC的患者,对于晚期CRC患者化疗仍是治疗过程中不可替代的重要策略。目前癌细胞对放化疗的抵抗限制了CRC临床治疗效果,因此迫切需要确定新的靶标以改善临床结果。长链非编码RNA（lncRNA）广泛参与人类机体的生理病理过程,在肿瘤增殖、凋亡、耐药、转移过程中起重要作用,且在多种类型肿瘤中均被证实拥有特定的表达谱。研究证实lncRNA PVT1在CRC细胞和组织中高表达,并且PVT1上调与CRC细胞增殖、浸润、肿瘤分期和淋巴结转移呈正相关,因此PVT1有望成为CRC诊断和判断预后的重要标志物。研究目的:研究lncRNA PVT1作为CRC的诊断和预后分子标志物的价值,并研究其对CRC细胞增殖、迁移及侵袭的影响,进一步寻找其可能吸附的miRNA分子以及具体作用机制,为CRC的早期诊断和治疗提供新的研究方向。研究方法:（1）临床组织学和细胞学检测、验证:采用荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）在4种CRC细胞株、72例结直肠癌患者手术标本中进行检测、验证。（2）PVT1与CRC患者生存率的关系,其作为CRC标志物诊断的灵敏度和特异度;其与CRC临床特性的关系:采用Kaplan–Meier分析和ROC曲线分析PVT1作为CRC诊断标志物在临床应用中的价值,卡方检验分析PVT1与CRC临床特性的关系。（3）PVT1对CRC细胞株增殖、迁移和浸润的影响:通过CCK8实验和流式细胞仪检测PVT1对CRC细胞增殖的影响,克隆实验以及划痕实验检测PVT1对CRC细胞浸润以及迁移的影响。（4）PVT1对miRNA分子的吸附研究以及可能机制:采用star Base,HMDD v2.0以及miRTar Base生物信息学数据库分析PVT1可能的下游miRNA分子（与CRC发病相关）,进一步通过荧光素酶报告和RNA pull down实验进行验证。qPCR验证目标miRNA分子在72对CRC患者术后标本中的表达。Pearson’s相关性分析证实PVT1与目标miRNA表达的相关性。体外,在HCT116和SW480细胞系中验证PVT1敲低后对目标miRNA表达的影响。（5）PVT1对调控CRC细胞增殖、浸润以及迁移的信号通路的研究:通过Western-blot检测VEGFA、p-VEGFR1、p-AKT等蛋白表达,探究PVT1作用于AKT信号通路的具体机制。（6）动物实验验证PVT1及其靶miRNA对裸鼠体外成瘤的影响:裸鼠皮下移植瘤实验从体内验证PVT1对CRC的影响,并对裸鼠的皮下瘤进行HE染色,检测Ki 67、CD 34、MMP 2以及MMP 9蛋白的表达。研究结果:（1）临床组织学和细胞学检测、验证:RT-PCR检测结果显示CRC术后患者的手术标本中,癌组织PVT1的表达量明显高于癌旁组织（P<0.01）,体外细胞系实验中,CRC细胞株中PVT1的表达量明显高于正常结肠黏膜细胞FHC（P<0.05）。（2）PVT1与CRC术后患者生存时间的关系,其作为CRC标志物诊断的灵敏度和特异度;其与CRC临床特性的关系:Kaplan–Meier分析提示,PVT1高表达的CRC患者生存时间明显低于低表达者（P=0.016）;ROC曲线提示PVT1对CRC诊断的灵敏度是0.653,特异度是0.944,其曲线下面积是0.81,具有显著的预测意义;卡方检验结果提示PVT1的表达与CRC淋巴结转移（P<0.01）,远处转移（P<0.05）以及TNM分期（P<0.01）密切相关。（3）PVT1对CRC细胞株增殖、迁移和侵袭的影响:CCK8以及流式细胞仪结果提示,CRC细胞在PVT1敲低后增殖受到抑制,CRC细胞生长停滞在S期;克隆实验提示PVT1敲低后CRC细胞的浸润受到抑制;划痕细胞实验提示PVT1敲低后CRC细胞迁移受到抑制。（4）PVT1对miRNA分子的吸附研究以及可能机制:采用star Base,HMDD v2.0以及miRTar Base生物信息学数据库分析提示PVT1可能结合的下游miRNA分子为miR-15a-5p,miR-15b-5p,miR-16-5p,miR-17-5p和miR-195-5p。然而,在这些micro RNA分子中,体内、外实验已证明miR-16-5p与CRC的发病机理密切相关。萤光素酶检测报告表明,miR-16-5p过表达后显着降低了包含完整PVT1序列载体的萤光素酶活性（P<0.01）。RNA pull down实验证实,在HCT116和SW480细胞中野生型miR-16-5p与突变体相比捕获了更多的PVT1。接着在72对CRC患者术后标本中验证miR-16-5p的表达,q RT-PCR结果表明miR-16-5p明显下调（P<0.05）。此外,相关性分析提示PVT1表达与CRC组织中miR-16-5p的表达呈负相关（r=-0.321,P<0.01）。体外细胞实验亦证实PVT1敲低后增加了HCT116和SW480细胞系中miR-16-5p的表达。综上所述,PVT1在CRC中充当miR-16-5p的miRNA“分子海绵”。（5）PVT1对调控CRC细胞增殖、浸润以及迁移的信号通路的研究:Western-blot检测结果提示PVT1吸附miR-16-5p后,通过上调VEGFA致VEGFA和其受体VEGFR1结合增多,磷酸化激活AKT信号通路。（6）动物实验验证PVT1及其靶miRNA miR-15-5p对裸鼠体外成瘤的影响:动物实验给予裸鼠皮下注射经shRNA-PVT1转染的或/和Agomir-16处理的HCT116细胞,以建立异种皮下移植瘤裸鼠模型（每组n=5）。sh-RNA PVT1或Agomir-16分别显著降低了肿瘤的体积和重量。与单独使用sh-RNA PVT1或Agomir16相比,sh-RNA PVT1和Agomir-16联合使用后肿瘤体积和重量更小。免疫组织化学（IHC）分析显示,与shRNA PVT1或Agomir-16组相比,sh-RNA PVT1+Agomir-16组的Ki 67,CD 34,MMP 2和MMP 9的表达降低。这些数据表明,PVT1沉默可抑制CRC在体内的生长和转移,而PVT1沉默与miR-16-5p过表达联合干预可表现出更强的肿瘤生长抑制作用。研究结论:（1）lncRNA PVT1在CRC组织中是高表达的;与淋巴结转移、远处转移、TNM分期以及患者术后生存时间均密切相关;在CRC诊断中具有良好的特异性和敏感性。（2）荧光素酶和RNA pull down实验证明lncRNA PVT1可以竞争结合miR-16-5p,两者存在碱基互补。（3）体外实验证实shRNA PVT1、Agomir-16转染入CRC细胞后,均可抑制CRC细胞的增殖、将细胞阻滞在S期,同时抑制CRC细胞的浸润、迁移;机制上可能是通过抑制血管内皮生长因子VEGFA表达,从而抑制其与血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）结合,使下游AKT信号通路失活,抑制血管新生和细胞凋亡。（4）体内实验证实shRNA PVT1、Agomir-16均可以抑制裸鼠皮下移植瘤生长,表现为皮下瘤体积和重量的下降,同时抑制Ki 67、CD34等血管形成标记物以及细胞基质金属蛋白MMP2、MMP9的表达,抑制肿瘤血管形成以及上皮间质转化。同样地shRNA PVT1与Agomir-16联用抑制效果最明显。