一氧化氮(NO)自由基作为信号分子,可参与多种生理生化代谢过程,其与蛋白质半胱氨酸巯基反应生成亚硝基硫醇的过程,称为蛋白质亚硝基化,可调控蛋白质活性、结构、功能和相互作用。NO和蛋白质亚硝基化在活体肌肉中可调控多种代谢过程,包括葡萄糖摄取、肌肉收缩和钙离子稳态等。在肉品领域,有报道表明通过调控宰前和宰后动物肌肉中NO水平可显著影响宰后成熟过程中肌肉的品质和生化代谢指标。然而,NO对猪肉成熟过程的调控作用及鲜肉品质的影响还未见报道。在机体内NO由一氧化氮合成酶(NOS)催化精氨酸向瓜氨酸代谢产生,在宰后24 h的猪肉中可持续检测到NOS的活性。因此,本文主要探究NO和蛋白质亚硝基化在宰后猪肉成熟过程中的作用途径,为揭示NO对鲜肉品质的影响及内在机制奠定基础。具体研究内容和结果如下:1.宰后猪肉成熟过程中NOS的变化规律研究研究了猪的不同肌肉中NOS在成熟过程中的变化。取猪宰后45 min内背部最长肌、腰大肌和半膜肌,真空包装,4℃成熟0、1、3d。结果表明,背部最长肌和腰大肌的NOS的活性随成熟时间逐渐降低(P<0.05),成熟第3d时,活性消失。而半膜肌的NOS活性最高(P<0.05),并且在成熟3 d内变化不显著(P>0.05)。神经型NOS(nNOS)作为肌肉中NOS表达的主要形式,在背部最长肌中和腰大肌中随成熟时间延长逐渐降解,成熟第3d降解基本完成。而半膜肌的nNOS的含量显著高于背部最长肌和腰大肌(P<0.05),成熟3d内含量保持不变。猪肉中NOS的含量和活性与肌纤维类型相关,并与肌球蛋白重链的ⅡA/X型呈正相关(P<0.05),与ⅡB型纤维呈负相关关系(P<0.05)。通过免疫组织荧光法检测nNOS在背部最长肌的表达发现,其分布主要在肌细胞膜的周围,但在细胞质也有少量分布,荧光强度随成熟时间逐渐减弱,与其含量变化趋势相对应。通过体外蛋白提取液模型和体内浸泡抑制剂研究表明,钙蛋白酶1是宰后成熟过程中降解nNOS的内源性蛋白酶。2.猪肉成熟过程中亚硝基化蛋白的鉴定使用还原的牛血清蛋白验证生物素转化法鉴定亚硝基化蛋白及其半胱氨酸位点的可行性,生物素转化法的关键性步骤包括自由巯基的封闭、亚硝基硫醇的还原与生物素标记、生物素标记的蛋白或半胱氨酸位点的纯化与富集,研究结果表明使用的N-乙基马来酰亚胺具有对自由巯基的较高的封闭率,而选用的生物素及树脂可有效标记和富集亚硝基化修饰位点,使用亚硝基谷胱甘肽(GSNO)诱导牛血清蛋白的亚硝基化并成功鉴定其半胱氨酸修饰位点。以猪背部最长肌成熟0、3d为研究对象,提取蛋白液,体外10和100μM GSNO诱导第0d蛋白样品的亚硝基化以探究其潜在的亚硝基化位点,使用上述验证的生物素转化法联合串联质谱多组分标签鉴定四组样品的亚硝基化蛋白,测定亚硝基硫醇和亚硝基化蛋白条带进行验证,结果显示,背部最长肌成熟第3 d的亚硝基硫醇显著高于第0 d(P<0.05),体外GSNO孵育组亚硝基硫醇显著高于第0d(P<0.05),100μM处理组含量最高(P<0.05),累计鉴定出343个亚硝基化蛋白,包含381个亚硝基化多肽的半胱氨酸位点。猪背部最长肌肉中,大量的蛋白质的半胱氨酸位点被鉴定出亚硝基化修饰,成熟过程中蛋白质亚硝基化表现出总体升高和动态变化的趋势,推测可能是去亚硝基化和转亚硝基化反应的发生。猪肉成熟过程中特征性差异蛋白包括糖酵解酶、热应激蛋白,氧化还原蛋白酶、钙离子释放通道蛋白和肌原纤维蛋白,可能参与成熟过程中的生理生化代谢,影响肉的品质。3.宰后猪肉中蛋白质亚硝基化修饰的特征与代谢途径分析以前一章节鉴定的343个蛋白与其对应的381个亚硝基化多肽的半胱氨酸位点为对象,使用生物信息学方法,研究宰后猪肉中亚硝基化蛋白和半胱氨酸修饰位点的特征。另外通过蛋白质的同源比对小鼠和人的蛋白组,设置阈值为E-value<10-5,同源性>60%,成熟第0和3d蛋白亚硝基化强度比率<0.67或>1.3筛选到139个差异性蛋白,并进行IPA进行代谢途径和细胞功能分析。结果表明,亚硝基化蛋白的分子量和pI分布范围较广,而半胱氨酸位点在二级结构上主要分布于α-螺旋、β-折叠和β-转角,极少分布于无规则卷曲结构。亚硝基化的修饰位点的一级结构模序为赖氨酸(K)位于修饰位点的-5、-7、+1和+5的位置,而未发生亚硝基化修饰的位点的一级结构模序为两个半胱氨酸相隔两个氨基酸残基的分布。亚硝基化蛋白广泛分布于肌细胞内,主要发挥酶活性功能参与宰后肌细胞的代谢过程。其中糖代谢过程是亚硝基化蛋白参与的最显著代谢途径(P<0.01),并且预测宰后肌肉中的蛋白质亚硝基化会抑制肌肉细胞死亡的过程。4.NO与钙蛋白酶抑制蛋白对钙激活酶活性和降解肌原纤维蛋白的影响以猪半膜肌为研究对象,提纯钙蛋白酶1和钙蛋白酶抑制蛋白,通过酪蛋白荧光法测定不同浓度NO供体NOR-3和不同添加量的钙蛋白酶抑制蛋白对钙蛋白酶1活性的影响,选取1000μM NOR-3和0.051 U钙蛋白酶抑制蛋白对0.125 U的抑制率50%和30%为交互作用梯度,设置以下五个处理组:钙蛋白酶1,钙蛋白酶1+钙蛋白酶抑制蛋白,钙蛋白酶1+NOR-3,钙蛋白酶1+钙蛋白酶抑制蛋白+NOR-3,钙蛋白酶1+NOR-3+钙蛋白酶抑制蛋白,体外模拟NO和钙蛋白酶抑制蛋白对钙蛋白酶1的活性、自溶及降解肌原纤维蛋白的影响。研究结果显示,NO供体可在钙蛋白酶抑制蛋白存在条件下修饰钙蛋白酶1,提高其亚硝基化强度和引起其氧化还原态的变化,形成蛋白交联,从而更进一步抑制了钙蛋白酶1的活性、自溶和降解肌纤维蛋白的能力。改变NOR-3和钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶孵育的顺序显著影响其抑制钙蛋白酶1的活性及小亚基的自溶程度(P<0.05),推测蛋白质亚硝基化可能影响钙蛋白酶1和钙蛋白酶抑制蛋白形成复合体的紧密程度。5.NO对肌原纤维蛋白及其对钙蛋白酶1敏感性的影响以猪半膜肌为研究对象,提纯钙蛋白酶1和肌原纤维蛋白,使用0、20、50、250、1000 GSNO与10 mg/ml肌原纤维蛋白混合,37℃孵育30 min,诱导NO对肌原纤维蛋白的修饰作用,并检测修饰后的肌原纤维蛋白对钙蛋白酶1敏感性的影响。结果表明,GSNO显著降低了肌原纤维蛋白的总巯基和游离巯基的含量(P<0.05),但对肌原纤维蛋白的表面疏水性影响不显著(P>0.05)。GSNO诱导了肌原纤维蛋白的亚硝基化修饰,总体蛋白的亚硝基化程度随GSNO浓度升高逐渐提高(P<0.05),并且不同蛋白对GSNO诱导亚硝基化修饰的敏感度存在差异(P<0.05)。另外,GSNO显著改变了肌原纤维蛋白的氧化还原状态,使蛋白内部或蛋白分子间形成二硫键,造成蛋白质之间的交联和聚合。GSNO修饰的肌原纤维蛋白改变了其对钙蛋白酶1的敏感性,提高了肌间线蛋白和肌联蛋白降解产物T2的降解程度(P<0.05),抑制了肌钙蛋白-T的降解程度(P<0.05)。因此,NO可改变肌原纤维蛋白的氧化还原状态并影响其被钙蛋白酶1的降解,影响肉的成熟品质。