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目的:比较两种间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)[骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSC)与脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell,UMSC)]来源的外泌体(Exosome,EXO)对急性心肌梗死的治疗效果差异,利用蛋白组学手段分析出现差异的分子机制,为应用EXO治疗缺血性心脏病的临床转化提供理论基础。方法:第一部分将冻存的P3代BMSC复苏培养并传代,胰酶-胶原酶消化法分离培养UMSC并传代,对P5代的细胞进行干细胞相关鉴定并进行下一步实验;差速超速离心法提取BMSC和UMSC培养上清液中的EXO并进行鉴定。第二部分通过体外和体内实验(外泌体心肌注射移植入大鼠急性心梗模型),进行两种外泌体对细胞相关功能及对心肌修复功能的比较,观察两者之间的差异。第三部分提取BMSC-EXO和UMSC-EXO中的蛋白,运用液相色谱-质谱联用分析方法鉴定蛋白并进行注释,筛选差异蛋白进行富集分析,根据分析结果选择典型差异蛋白进行体外验证。结果:复苏接种的P3代BMSC形态均一,呈梭形或纺锤形,5天左右融合达90%以上;经酶消化法贴壁培养得到的UMSC呈成纤维细胞样,呈多角形或梭形,培养3周细胞融合比例超过80%。MSC传代后生长速度明显加快。流式细胞仪检测:超过95%的 BMSC 和 UMSC 表达 CD44、CD90 和 CD105;不表达 CD34 和 HLA-DR。生长曲线显示P5代的UMSC增殖速度明显较BMSC快。在同样诱导条件下,BMSC和UMSC均能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,BMSC更易被诱导为脂肪细胞和软骨细胞,而UMSC则易被诱导为成骨细胞。透射电镜观察MSC-EXO呈典型的“杯托样”结构,内可见低密度光亮区;粒径分析结果,BMSC-EXO平均粒径131.5nm,UMSC-EXO 平均粒径 13 7.5nm;Western Blot 显示 BMSC 和 UMSC 来源的EXO均为CD63、TSG101阳性表达。体外实验结果:两种来源MSC的EXO均能抑制H2O2诱导的H9C2细胞凋亡、在体外诱导HUVEC细胞加速迁移和形成管样结构、在体外抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。UMSC-EXO在上述调控能力上优于BMSC-EXO。体内实验结果:术后3天见UMSC-EXO在心肌组织内驻留率更高。HE染色、RT-qPCR、Western Blot结果提示经EXO处理后,心梗区域炎性细胞浸润减少,炎症因子IL-6、TNF-α、IκBα、NF-κB p65表达降低,与凋亡相关的Bax、cleaved-Caspase3的表达降低、Bcl2表达增加,与纤维化相关的MMP-2、MMP-9表达降低、与血管新生相关的eNOS、VEGF表达增加。天狼猩红染色、Masson’s Trichrome染色、TUNEL染色和CD31染色结果显示MSC-EXO能抑制梗死后心肌间质纤维化、抑制心肌细胞凋亡、促进新生血管形成。心脏超声结果提示MSC-EXO能提高急性心梗后的心脏功能。上述指标UMSC-EXO移植组较BMSC-EXO移植组改善更显著。使用液相色谱-质谱联用分析法鉴定到BMSC-EXO中可定量蛋白624个,UMSC-EXO中可定量蛋白635个,两者共同表达的蛋白为558个,139个蛋白在BMSC-EXO中表达上调,153个蛋白在UMSC-EXO中表达上调。富集分析显示UMSC-EXO中的差异上调蛋白较BMSC-EXO能更多地发挥细胞粘附、促细胞增殖和存活、抗凋亡及炎症调节等功能。筛选有明显表达差异的蛋白PDGFC进行验证结果:转染过表达靶向PDGFC的shRNA的UMSC,其EXO中的PDGFC含量下降,使用该外泌体体外与HUVEC细胞共培养后,HUVEC细胞中p-AKT的表达下降,形成管状结构能力下降。结论:BMSC-EXO和UMSC-EXO在体外均可以提高心肌细胞抗凋亡能力、促进内皮细胞增殖迁移及形成管样结构、抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的程度。在体内均能够减轻急性心梗后局部炎性反应,改善心肌细胞存活率,降低心肌组织纤维化程度,促进毛细血管新生,改善心脏功能。总体效果UMSC-EXO较BMSC-EXO更好,其原因可能与其包含的蛋白成分差异有关。MSC-EXO中包含的蛋白质在心梗后心肌修复过程中发挥了一定的作用,而差异蛋白(如PDGFC)表达量的不同可能是不同来源MSC外泌体在心肌修复过程中产生差异的原因之一。