论文部分内容阅读
背景食管癌是全球第八大最常见的恶性肿瘤,死亡率在所有类型的肿瘤中排在第六位,且发生率因地域而异。食管癌主要分为鳞状细胞癌(Esophagus Squamous Cell Carcinoma,ESCC)和腺癌。中国是食管癌的高发地区,90%以上的食管癌是ESCC。由于食管癌早期症状不明显,大多数患者在确诊时都已经是中晚期,已经发生淋巴转移和组织浸润,这也是食管癌患者预后不佳的主要原因。尽管在食管癌综合治疗方面取得了一定的进展,但总体存活率仍然很低,五年存活率仅为15-34%。到目前为止,影响食管癌的发展及预后的因素仍然不清楚。因此,寻找食管癌发病和进展的关键分子,完善食管癌发生和发展的分子机理,为食管癌的诊断和治疗提供新的靶点和方向,寻找出食管癌诊断、治疗以及预后的的生物标志物仍然是迫切需要的,对于临床诊断、提供治疗策略具有重大意义。肝细胞生长因子/c-间叶-上皮转化受体酪氨酸激酶(Hepatocyte Growth Factor/c-mesenchymal-epithelial transition receptor tyrosine kinase,HGF/c-MET RTK)信号通路在正常组织中处于失活状态,而在多种类型的恶性肿瘤中则异常激活。相关研究证实抑制HGF/c-MET信号通路可以作为治疗多种癌症类型的有效策略,如非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)肝癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌、子宫内膜癌等。但是HGF在食管鳞癌中的作用少见报道,我们在前期的工作中发现HGF作为一种多功能的细胞因子,在ESCC中与cyclin E协同高表达,且与ESCC的分化程度、TNM分期密切有关,影响着患者的预后。因此为了研究HGF对ESCC发生和发展的影响及其参与的具体分子机理,从而为临床诊断、治疗ESCC提供新的靶点。本研究主要通过分子信息学研究和体内外实验来探讨HGF对ESCC的影响及其分子机理。第一部分HGF在食管癌中的表达及意义目的:本部分研究主要分析ESCC中的基因表达图谱以及影响其发生和发展的信号通路方法:首先利用RNA-seq方法分析ESCC患者食管癌组织及癌旁组织中的基因表达差异,筛选与ESCC相关基因并分析HGF在食管癌中表达情况,KEGG信号通路分析预测了所筛选基因在与癌症相关信号通路中的富集情况,并利用Real-Time PCR对测序结果进行进一步的验证。进一步利用TCGA数据库分析食管癌中HGF与cyclin E的表达是否存在协同性以及HGF表达高低与患者肿瘤分期和预后的关系。最后利用Real-Time PCR、Western blotting和免疫组化等分子生物学手段分析HGF在ESCC组织及癌旁组织的表达情况。结果:我们发现29个基因在食管癌组织中呈高表达,4个基因在食管癌组织中呈低表达,其中HGF和cyclin E在食管癌组织中均呈高表达。通过KEGG信号通路分析发现PI3K/AKT信号通路在食管癌组织中是激活最明显的信号通路。Real-Time PCR进一步验证了通过RNA-seq分析出的差异表达基因,HGF、cyclin E基因在食管癌组织中均表达上调(p<0.05)。通过TCGA数据库分析发现与对应的癌旁组织相比,食管癌组织中HGF和cyclin E呈高表达并且存在协同性(p<0.01)。TCGA数据库分析结果发现:HGF低表达的食管癌患者的无进展生存期和总体生存时间显著优于对照组,食管癌组织中的HGF表达水平越高,肿瘤的病理分期越晚(p<0.05)。Real-Time PCR、Western blotting和免疫组化等分子生物学分析结果发现,与对应的癌旁组织相比,ESCC组织中的HGF无论是mRNA水平还是蛋白水平呈高表达(p<0.05)。结论:HGF广泛存在食管癌肿瘤细胞中,并且可能通过参与PI3K/AKT信号通路影响食管癌的发生发展,并随着肿瘤的进展HGF的表达也逐渐增加,与患者的无病生存期及总生存时间呈负相关。第二部分 HGF对食管鳞癌细胞生物学功能的影响目的:本部分研究主要探究HGF对ESCC细胞生物学功能的影响,从而为临床将HGF作为ESCC治疗靶点提供新的理论基础。方法:本部分从ESCC细胞水平探究HGF对细胞存活、增殖、侵袭、凋亡以及肿瘤形成的影响。首先,选取2个ESCC细胞系,Real-Time PCR分析HGF基因表达情况,将细胞系分为HGF低表达和高表达,并利用Real-Time PCR、Western blotting和免疫荧光分别从mRNA水平和蛋白水平分析了两个细胞系中HGF的表达和定位。Western blotting 方法检测了 EC9706 和 KYSE-2 中 E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达情况。然后在HGF高表达的细胞系中利用shRNA敲低HGF的表达,在HGF低表达的细胞系中利用cDNA过表达HGF。利用CCK-8试验检测HGF表达变化对ESCC细胞活性的影响;利用克隆形成试验检测HGF表达变化对ESCC细胞增殖的影响;流式细胞仪检测两组细胞系细胞周期;Western blotting检测了 HGF表达变化对ESCC细胞周期相关蛋白表达的影响;Annexin V试验检测两组细胞系细胞凋亡;利用Western blotting检测了 HGF表达变化对ESCC细胞凋亡相关蛋白表达的影响;Real-Time PCR、Western blotting方法检测了过表达和敲低HGF后细胞系中E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达情况;Transwell试验检测过表达和敲低HGF后细胞系中ESCC细胞迁移和侵袭情况;小鼠皮下移植瘤模型探究过表达和敲低HGF后细胞系ESCC细胞肿瘤形成的情况;HE染色和Tunel试验观察小鼠肿瘤组织细胞的凋亡情况。分析HGF表达的改变对细胞存活、增殖、侵袭、凋亡以及肿瘤形成的影响。结果:Real-Time PCR和实验结果发现,HGF在KYSE-2细胞系中呈低表达,在EC9706细胞系中呈高表达(p<0.01)。Western blotting检测发现EC9706中HGF的蛋白表达水平显著高于KYSE-2(p<0.05)。鉴定HGF高表达与低表达细胞系后,我们利用免疫荧光对两个细胞系中HGF的表达定位进行了分析,结果发现在HGF高表达的EC9706中,HGF主要定位在核里;在HGF低表达的KYSE-2中,HGF主要定位在胞质中。Western blotting检测结果显示与HGF低表达的KYSE-2相比,HGF高表达的EC9706中E-cadherin表达较低,而N-cadherin和vimentin表达较高(p<0.05),提示HGF高表达的ESCC细胞系更容易发生EMT。利用CCK-8试验检测HGF表达变化对ESCC细胞活性的影响,结果发现HGF的过表达能够显著提高细胞的活性(p<0.05);与之相反,HGF的敲低能够显著抑制细胞的活性(p<0.05)。克隆形成试验检测结果发现,HGF的过表达能够显著促进细胞的增殖(p<0.01);HGF的敲低能够显著抑制细胞的增殖(p<0.01)。流式细胞仪检测结果发现,HGF过表达后细胞处在S期的比例显著增多,G1期比例显著减少(p<0.01);在EC9706中敲低HGF的表达,结果发现HGF的敲低细胞处在S期的比例显著减少,G1期比例显著增多(p<0.05)。Western blotting方法检测HGF表达变化对ESCC细胞周期相关蛋白表达的影响,结果发现HGF过表达能够显著促进KYSE-2中PCNA和Cyclin D1的表达(p<0.05);HGF的敲低能够显著抑制EC9706中PCNA和Cyclin D1的表达(p<0.05)。利用Annexin V试验检测HGF表达变化对ESCC细胞凋亡的影响,结果发现HGF过表达后细胞凋亡的比例显著减少(p<0.05);HGF的敲低细胞凋亡比例显著增多(p<0.05)。随后,我们利用Western blotting检测了 HGF表达变化对ESCC细胞凋亡相关蛋白表达的影响,结果发现HGF过表达能够显著抑制KYSE-2中Caspase-7和Caspase-9的表达(p<0.05);HGF的敲低能够显著促进 EC9706 中 Caspase-7和Caspase-9 的表达(p<0.05)。利用 Real-Time PCR、Western blotting和免疫荧光等分子生物学手段检测HGF表达变化对ESCC细胞EMT相关蛋白表达的影响,结果发现与HGF的过表达后HGF主要聚集在KYSE-2细胞核内,并且能够抑制E-cadherin的表达,促进N-cadherin和vimentin的表达(p<0.05);HGF的敲低后HGF主要分布在EC9706细胞胞质中,并且能够促进 E-cadherin 的表达,抑制 N-cadherin和vimentin 的表达(p<0.05)。Transwell试验检测两组细胞系中ESCC细胞侵袭情况结果发现,HGF的过表达能够显著促进细胞的侵袭(p<0.05);HGF的敲低能够显著抑制细胞的侵袭(p<0.05)。我们通过小鼠皮下移植瘤模型探究HGF表达变化对ESCC细胞肿瘤形成的影响。结果发现HGF的过表达能够显著促进肿瘤的形成和生长(p<0.01);HE染色和Tunel试验显示HGF的过表达能够显著促进肿瘤组织内细胞的增殖,抑制细胞的凋亡(p<0.01)。HGF的敲低能够显著抑制肿瘤的形成和生长(p<0.01);HE染色和Tunel试验显示HGF的敲低能够显著抑制肿瘤组织内细胞的增殖,促进细胞的凋亡(p<0.01)。结论:本部分研究我们通过体外细胞实验和体内移植瘤模型证明HGF能够促进ESCC细胞的增殖、存活、侵袭,抑制细胞的凋亡,促进ESCC肿瘤的形成。第三部分HGF影响食管鳞癌细胞生物学性的分子机制目的:本部分研究主要探究HGF影响ESCC细胞生物学性的分子机制。方法:我们首先Western blotting和免疫组化方法检测了 ESCC组织、癌旁组织中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况;再用Western blotting方法检测了 ESCC细胞系中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。随后,我们在两个细胞系中改变HGF的表达,检测PI3K/AKT信号通路的激活情况;Western blotting方法检测了过表达或者敲低HGF的ESCC细胞系中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况;免疫组化方法检测小鼠皮下移植瘤中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。我们在HGF低表达的细胞系中过表达HGF,再利用PI3K抑制剂处理细胞,在HGF高表达的细胞系中敲低HGF的表达,再利用PI3K激动剂处理细胞。利用克隆形成试验检测HGF表达变化对ESCC细胞增殖的影响;Transwell试验检测两组细胞系中ESCC细胞迁移和侵袭情况;小鼠皮下移植瘤模型探究上述细胞系ESCC细胞肿瘤形成的情况。以此观察细胞增殖、侵袭以及肿瘤形成的能力。结果:Western blotting和免疫组化实验结果显示与对应的癌旁组织相比,ESCC组织中HGF呈高表达,PI3K/AKT信号通路中的AKT、mTOR的磷酸化水平显著增高(p<0.05),且PI3K/AKT信号通路中上游负调控蛋白PTEN的表达显著降低(p<0.05)。Western blotting实验结果显示与KYSE-2细胞系相比,EC9706细胞系中AKT、mTOR的磷酸化水平显著增高,PTEN的表达显著降低(p<0.05);此外,我们还发现HGF高表达的EC9706细胞系中cycin E的表达也会异常增高(p<0.05)。Western blotting实验结果显示HGF的过表达会显著促进AKT和mTOR的磷酸化水平,显著抑制PTEN的表达,同时会促进cyclin E的表达(p<0.05);敲低HGF的表达,我们发现AKT和mTOR的磷酸化水平显著降低,PTEN的表达水平显著增高,同时会抑制cyclin E的表达(p<0.05)。小鼠皮下移植瘤免疫组化实验结果显示HGF过表达能够促进肿瘤中AKT的磷酸化,抑制PTEN的表达(p<0.05);HGF的敲低能够抑制肿瘤中AKT的磷酸化水平,促进PTEN的表达(p<0.05)。克隆形成实验结果发现PI3K抑制剂则会显著抑制细胞克隆的形成(p<0.01);而PI3K激动剂剂则会显著促进细胞克隆的形成(p<0.01)。Transwell试验结果发现,HGF过表达能够显著促进细胞的侵袭,而HGF过表达+PI3K抑制剂则会显著抑制细胞的侵袭(p<0.05);HGF敲低能够显著抑制细胞的侵袭,而HGF敲低+PI3K激动剂剂则会显著促进细胞的侵袭(p<0.05)。小鼠皮下移植瘤模型实验结果显示HGF过表达能够显著促进细胞肿瘤的形成,而HGF过表达+PI3K抑制剂则会显著抑制细胞肿瘤的形成(p<0.01)。HGF敲低能够显著抑制细胞肿瘤的形成,而HGF敲低+PI3K激动剂剂则会显著促进细胞肿瘤的形成(p<0.01)。结论:通过本部分研究,我们证明了 HGF主要作用于PI3K/AKT信号通路的上游,抑制PTEN的表达、促进AKT和mTOR的磷酸化,激活PI3K/AKT信号通路,进而促进ESCC细胞的增殖、侵袭和肿瘤的形成。因此,HGF及其调控的PI3K/AKT信号通路可以作为临床ESCC治疗的潜在靶点。