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目的:本课题旨在采用响应面法优选不同方法提取的卡西卡甫枣果总黄酮(FZM)工艺,建立稳定的卡西卡甫枣果黄酮类成分薄层鉴别(TLC)及高效液相色谱(HPLC)检测方法,进一步观察FZM对金黄色葡萄球菌(SA)和口腔变异链球菌的细菌生物膜(BBF)体外抗菌活性,以及探讨FZM对人脑胶质瘤U251细胞凋亡、细胞周期和自噬的影响。方法:选取料液比、乙醇体积分数和提取时间3个因素为考察指标,采用响应面法分析优化卡西卡甫枣果常规提取工艺。采用细胞计数法对卡西卡甫枣果破壁时间及破壁率的影响进行考察,随后选取料液比、乙醇体积分数和提取时间3个因素为考察指标,采用响应面法分析优化卡西卡甫枣果破壁提取工艺。TLC鉴别以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸-水(6:1:1:1:1)为展开剂,在紫外光灯254 nm下进行荧光检视。HPLC法色谱条件:色谱柱AgilentHCC18(250X4.6 mm,5μm),以乙腈-水(体积分数20%-80%)为流动相,流速:0.8mL.min-1,检测器在258 nm处进行检测。体外培养SA及口腔变异链球菌BBF,FZM干预后采用结晶紫染色半定量法检测BBF,采用倒置显微镜观察FZM干预后生物膜变化情况,采用碘化丙啶(PI)和FITC-ConA分别标记细菌DNA和多糖,激光扫描共聚焦显微镜检测BBF的数量和厚度,通过激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察BBF结构。FZM干预U251细胞后,采用MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双标法检测FZM对胶质瘤细胞凋亡的作用,q-PCR检测自噬基因MAP1LC3B、BECN]的表达。结果:(1)响应面法优选了卡西卡甫枣果总黄酮提取工艺:提取时间1.7 h、提取温度74℃、料液比1:27,得到FZM含量平均为1.403 mg.g-1,说明该方程与实际情况拟合较好,所建模型正确。(2)响应面法优化破壁提取FZM的工艺:提取温度74℃、提取时间1.7 h、料液比1:26,得到FZM含量平均为1.435 mg.g-1。对比前处理后未经破壁处理的卡西卡甫枣果优化工艺提取得到FZM含量相比降低了 2.24%。(3)试验检出芦丁、斯皮诺素的Rf值分别为0.56、0.45,供试品色谱斑点清晰,无拖尾、背景无干扰,重复3次,结果相同。表明该鉴别方法特异性强、分离效果佳、重现性好。HPLC法测得芦丁的平均含量为0.078%,RSD为1.94%;斯皮诺素的平均含量为0.048,RSD为1.85%,准确可靠,可用于卡西卡甫枣果的质量控制。(4)FZM对口腔变异链球菌细菌生物膜无明显抑制作用。FZM对金黄色葡萄球菌生物膜有较强的抑制作用。形态学观察可见生物膜被破坏,基质样物变稀疏,细菌群聚大为降低。通过激光扫描共聚焦显微镜对BBF厚度的检测,我们可发现,FZM作用后BBF厚度明显减轻,同时采用Image-Pro Plus 6.0图片分析软件对CLSM图片中FITC ConA荧光强度分析,发现死菌比例均较空白对照组明显增多,生物膜比例均较空白对照组明显减少,随后通过扫描电镜观察,发现FZM可破坏细菌生物膜物质交换的孔道,使得细菌逐渐被裸露游离,破坏细菌生物膜三维结构。(5)FZM剂量依赖性地抑制U251细胞增殖率,当浓度为25μg.mL-时,最大抑制率达到峰值88.72%,24 h的IC50为7.116 μg.mL-1,在进一步应用Annexin V-FITC/PI双染检测FZM对胶质瘤细胞凋亡的影响中,发现FZM剂量依赖性地促进细胞凋亡,在FZM为25μg.mL-1时,细胞凋亡率达到峰值91.1%,同时,FZM可上调自噬基因MAPlLC3BmRNA,差异显著;BECN1 mRNA的表达,差异不显著。提示FZM对人脑胶质瘤细胞U251存在自噬作用,而其抑制作用有可能与非经典自噬通路有关。结论:综上,响应面法优选了卡西卡甫枣果总黄酮常规提取工艺,验证试验表明该方法简便、可行,可用于卡西卡甫枣总黄酮的高效提取,响应面法优化破壁提取FZM的工艺,对比常规回流提取与超声波细胞破壁提取方法,结果表明,超声波细胞破壁提取法操作时间短、总黄酮含量高,适用于卡西卡甫枣果总黄酮的高效提取。建立稳定的卡西卡甫枣果黄酮类成分薄层鉴别及HPLC检测方法,准确可靠,可用于FZM的质量控制。FZM对口腔变异链球菌细菌生物膜无明显抑制作用。FZM对金黄色葡萄球菌生物膜有较强的抑制作用。FZM是通过清除细菌胞外多糖的保护膜,破坏生物膜内可供物质交换的孔道从而达到抑菌和清除细菌生物膜的作用效果。FZM对人脑胶质瘤细胞U251具有一定抑制作用,同时进一步的研究发现其抑制作用可能是通过凋亡和自噬两大途径发生的。然而这是否跟细胞自噬凋亡的互反馈调节有关,仍需我们进一步的研究探讨。