D-苯丙氨酸是一种重要的非天然氨基酸,虽然不参与蛋白质的合成,但它是杆菌肽、真菌孢肽、短杆菌肽S、多粘菌素B等多肽类抗生素的重要前体,也是降血糖药物、抗肿瘤药物和艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的合成前体。工业上生产D-苯丙氨酸主要通过化学法合成DL-苯丙氨酸外消旋体,再进行拆分,但该方法工艺复杂、产物纯度低、污染严重。随着代谢工程技术的发展,使得微生物发酵法合成D-苯丙氨酸成为可能,该方法具有原料廉价易得、产物纯度高、环境友好等优点。本研究在本实验室L-苯丙氨酸和L-苯甘氨酸生物合成研究的基础上,以在Escherichia coli中构建一条以葡萄糖为碳源的D-苯丙氨酸生物合成途径为主要研究内容,为其它D型氨基酸的合成提供理论依据和实践基础,主要研究内容和结果有:1、敲除酪氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶基因和D-丙氨酸脱氢酶基因阻断分支代谢途径采用酪氨酸转氨酶(tyrB)、天冬氨酸转氨酶(aspC)和支链氨基酸转氨酶(ilv E)缺失菌株E.coli W14B、E.coli BC和E.coli BCE及通过λRed重组技术敲除D-丙氨酸脱氢酶(dad A)基因的菌株E.coli BCA和E.coli BCEA作为D-苯丙氨酸生产菌株。通过摇瓶发酵检测突变菌生长状态,发现tyr B、ilv E和dad A基因的缺失对菌体生长没有显著的影响,E.coli BC、E.coli BCE、E.coli BCA和E.coli BCEA是L-天冬氨酸缺陷型菌株。2、异源表达D-氨基酸转氨酶增强D-苯丙氨酸合成代谢途径克隆Bacillus subtilis、B.licheniformis和B.amyloliquefaciens来源的D-氨基酸转氨酶基因datBS、datBL和datBA,分别在E.coli BL21(DE3)中实现高效表达,产物构型鉴定表明Dat都具有合成D-苯丙氨酸的能力。Dat的最适反应温度都是45 oC;在37-50 oC具有较好的热稳定性。Dat的最适p H在8.0左右,在p H 7.5-8.0具有良好的p H稳定性。DatBA的比活力最高,为466 U×g-1蛋白,DatBS次之,DatBL最低;但DatBS催化的反应液中D-苯丙氨酸的浓度最高,是DatBL的1.29倍,DatBA的6.32倍,说明DatBS具有更强的D-苯丙氨酸的合成能力。3、温度诱导表达D-氨基酸转氨酶和丙氨酸消旋酶,增强前体供应,构建D-苯丙氨酸生产菌株将基因dat和alr与温度诱导型启动子PR相连,实现dat和alr温控表达后连接至载体p R15ABK上,构建重组质粒p R15ABKp Rdat和p R15ABKAp Rdat,并导入工程菌E.coli W14B、E.coli BC、E.coli BCE、E.coli BCA和E.coli BCEA。发酵结果表明,重组菌E.coli BCEA(p R15ABKAp RdatBS)发酵60 h时D-苯丙氨酸的产量最大,最高达到1.72 g×L-1,在构建的所有菌株中产D-苯丙氨酸的量是最高的,达到了目前未补加任何前体物质时微生物发酵法产D-苯丙氨酸的最高水平。综上所述,本研究在本实验室L-苯丙氨酸及L-苯甘氨酸研究的基础上,继续延伸L-苯丙氨酸合成途径,通过弱化分支代谢途径、异源表达D-氨基酸转氨酶、温控表达D-氨基酸转氨酶和丙氨酸消旋酶构建了一条以葡萄糖作为碳源的D-苯丙氨酸生物合成途径,实现了D-苯丙氨酸的微生物发酵法合成,达到了目前未补加任何前体物质时微生物发酵法产D-苯丙氨酸的最高水平。本研究的D-苯丙氨酸生产水平虽未达到工业生产的程度,但仍能为生物合成其它D型氨基酸提供借鉴。