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一、背景与目的刺槐素是一种分布广泛的黄酮类物质,具有抗氧化,抗炎及抗房颤等药理作用,对乳腺癌,胃癌及前列腺癌等具有一定的治疗作用。然而,大多数黄酮可发生广泛的 UGT(UDP-glucuronosyltransferases)和 SULT(sulfotransferase)代谢,极大影响其体内生物利用度和药效作用。刺槐素在体外具有良好药效,但是尚未完全阐明的代谢处置机制严重制约其成药性,因此,深入的代谢机制研究,对黄酮类药物的药效机制和开发具有重要意义。本实验室已对刺槐素UGT代谢进行广泛地研究,而刺槐素SULT代谢的相关研究却鲜有报道。研究证实许多黄酮的结合物是外排蛋白的底物。大量证据表明药物代谢酶与外排蛋白对黄酮的体内处置具有协同作用。然而,刺槐素SULT代谢处置是否由SULT酶或者外排蛋白,还是两者共同参与仍不清楚。因此,阐明刺槐素SULT代谢处置过程将有助于认知其体内显效机制。因此,我们采用体内与体外模型联合的策略首次系统地研究刺槐素SULT代谢处置机制。首先建立一个灵敏可靠的UHPLC-MS/MS方法对刺槐素及其SULT代谢物同时定量。运用此方法,通过刺槐素SULT代谢体外孵育实验,考察其体外的SULT代谢特点。外排蛋白基因敲除小鼠的药动学来研究BCRP、MRP1和MRP2对刺槐素SULT代谢物的转运作用。Caco-2细胞模型结合相对选择性抑制剂用以模拟刺槐素在肠道的吸收代谢和确证外排蛋白对刺槐素SULT代谢物的转运作用。二、实验方法1.刺槐素7位磺酸化物的鉴定及质谱定量方法的建立利用Agilent UHPLC-DAD-QTOF MS鉴定刺槐素的SULT代谢产物,同时建立检测刺槐素及其SULT代谢物的质谱MRM方法。2.刺槐素的体外SULT代谢机理采用5种雄性种属(人,猴,大鼠,小鼠和犬)肝脏组织S9和5种人源化SULT(1A1,1B1,1E1,2A1和2B1)亚酶分别研究刺槐素在不同种属及亚酶的SULT代谢特点。3.刺槐素在小鼠体内的生物利用度及药代动力学口服或尾静脉给药野生型FVB,Bcrp-/-,Mrp1-/-和Mrp2-/-小鼠,在预定时间点收集样品,并测量血药浓度,用WinNonlin(?)3.3非房室模型计算药动学参数。4.刺槐素在小鼠肝脏,小肠及结肠组织S9介导的酶代动力学采用野生型FVB,Bcrp-/-,Mrp1-/-和Mrp2-/-小鼠肝脏,小肠及结肠组织S9分别考察刺槐素的SULT代谢的酶动学特征。5.外排转运蛋白对刺槐素SULT代谢物的转运机制采用Caco-2细胞模型结合相对选择性的外排蛋白抑制剂(BCRP抑制剂Ko143,MRP2 和 MRP1 抑制剂 MK571)来研究 MRP1,MRP2 以及 BCRP 对Aca-7-S的转运作用。三、结果与讨论1.刺槐素7位磺酸化代谢物的鉴定刺槐素的磺酸化结合的位置为7位羟基,对应的代谢产物为刺槐素7位磺酸化代谢物(Aca-7-S)。2.刺槐素体外SULT代谢具有明显的种属及亚型差异性Aca-7-S是刺槐素SULT代谢体外孵育的主要暴露形式。SULT1A1是介导刺槐素SULT代谢的主要亚型。不同SULT酶的磺酸化催化速率顺序:SULT1A1>SULT1E1>SULT1B1>SULT2A1>SULT2B1。犬对刺槐素 SULT 代谢具有最快的代谢速率。不同种属的磺酸化催化速率顺序:犬>大鼠>人>猴>小鼠。3.刺槐素在小鼠体内的生物利用度及药代动力学刺槐素在野生型FVB小鼠体内的生物利用度为7.4%,表明刺槐素的体内生物利用度较低。Aca-7-S是刺槐素体内SULT代谢的主要暴露形式。Aca-7-S在Bcrp-/-小鼠的AUC0-∞显著高于野生型FVB小鼠(p<0.05),而Mrp1-/-小鼠的AUC0-∞则显著低于野生型FVB小鼠(p<0.05)。说明MRP1与BCRP参与Aca-7-S的外排;MRP2未参与Aca-7-S的转运。4.刺槐素在小鼠肝脏,小肠及结肠组织S9介导的酶代动力学Mrp1-/-和Bcrp-/-小鼠的小肠组织S9对刺槐素SULT代谢的酶动学特征为米氏方程模型;四种小鼠的其他组织S9对刺槐素SULT代谢的酶动学特征均为底物抑制模型。说明四种小鼠的肝脏和结肠组织S9对刺槐素SULT代谢的代谢特征相同。5.BCRP和MRP1对刺槐素7位磺酸化物的转运作用MRP1抑制剂MK571和BCRP抑制剂Ko143可分别显著降低Aca-7-S在BL面和AP面的外排率及清除率;显著提高胞内Aca-7-S的含量(p<0.05),表明MRP1与BCRP可能负责Aca-7-S的外排;MRP2可能未参与Aca-7-S的转运。此结果与药动学结果相符,进一步确认MRP1与BCRP对Aca-7-S的外排作用。四、结论刺槐素的SULT代谢主要由SULT1A1介导,Aca-7-S是刺槐素SULT代谢的主要暴露形式,BCRP和MRP1主要参与Aca-7-S的外排。刺槐素的SULT代谢具有明显的种属及亚型差异性。犬对刺槐素的SULT代谢速率最快。SULT1A1,MRP1和BCRP共同调控Aca-7-S的体内暴露。