论文部分内容阅读
目的分别采用N-琥珀酰亚胺-3-[正丁基锡]苯甲酸酯（ATE）、Iodogen法标记AC133.1单克隆抗体（mAb）,通过体外、体内实验比较两种标记法的优劣。方法1.腹水法制备AC133.1 mAb。2.ATE法标记AC133.1 mAb。131]与ATE反应得到中间产物N-琥珀酰亚胺-3[131I]苯甲酸酯（131I-SIB）,采用高效液相色谱分离纯化131I-SIB,131I-SIB与AC133.1mAb在碱性环境（pH=8.7）下完成偶联。3.Iodogen固相氧化法标记AC133.1 mAb。4.标记物在胎牛血清（FBS）中的稳定性实验。将上述标记物与适量体积的FBS混匀置于37℃环境中,于不同时刻（0d,1d,3d,7d）测定标记物的放化纯（RCP）。5.通过细胞饱和实验测定标记抗体与相应抗原的平衡解离常数Kd。6.测定甲状腺及肿瘤组织的放射性分布,结果以%ID/g表示。7.统计学方法:独立样本的t检验（SPSS statistics 17.0）,P<0.05为具有统计学差异。结果1.AC133.1 mAb 的浓度为 4 μg/μl。2.131I-SIB的紫外峰保留时间约11.0 min,对应的放射峰保留时间约12.0 min。ATE法标记的AC133.1mAn)（131I-SIB-AC133.11 mAb）的标记率为 70.75±5.59%,RCP为 91.05 ± 1.53%;Iodogen 法标记的 AC133.1 mAb（131I-AC133.1 mAb）的标记率为71.02 ± 7.00%,RCP 为 92.36 ± 1.97%。3.131I-SI-AC133.1 mAb在37℃下于FBS中的不同时刻（0 d,1d,3d,7 d）对应的 RCP 分别为:91.05 ± 1.53%、89.52 ± 1.64%、85.31 ± 1.96%、79.64 ± 1.33%;131I-AC133.1 mAb 对应的 RCP 分别为:92.36 ± 1.97%、90.14 ± 1.36%、86.52±2.68%、81.20± 3.75%。同一时间点,131I-SIB-AC133.1 mAb 的 RCP 与 131I-AC133.1 mAb 相比无明显差异。4.ATE 法对应的 KD 为（4.76±0.30）×10-8M,Iodogen 法对应的 KD 为（4.05±0.19）× 10-8M,两种标记法所得的KD无明显差异（P=0.254）。5.131I-SIB-AC133.1mAb 在肿瘤组织不同时刻（1d,3d,5d,7d）的ID/g 分别为:4.63 ±0.07、8.61 ±0.34、7.28± 0.11、6.62 ±0.16,131I-AC133.1 mAb 在肿瘤组织不同时刻（1d,3d,5d,7d）的%ID/g分别为..2.91 ± 0.26、6.25±0.18、5.18±0.47、4.64±0.29,同一时刻（1d,3d,5d,7d）肿瘤组织对1311-SIB-AC133.1 mAb的摄取高于131I-AC133.1mAb（对应为P=0.001,P<0.001,P=0.002,P<0.001）。6.不同时刻（1d,3d,5 d,7 d）ATE法对应的甲状腺组织的放射性摄取分别为:0.99 ± 0.12、0.82 ±0.05、0.74 ± 0.21、0.35 ± 0.05,不同时刻（1d,3d,5 d,7 d）lodogen法对应的甲状腺组织放射性摄取分别为:2.48±0.18、2.05±0.26、1.76±0.34、1.32±0.13。同一时刻（1d,3d,5d,7d）Iodogen法对应的甲状腺组织放射性摄取高于 ATE 法（分别为P<0.001,P=0.001,P=0.005,P<0.001）。结论ATE法标记抗体具有较好的体内稳定性。目的本研究以CD133为结肠癌干细胞靶点,观测靶向CD133（+）肿瘤干细胞（CSCs）放射免疫治疗（RIT）对肿瘤生长的影响。方法1.131I标记AC133.1单克隆抗体（mAb）采用N-琥珀酰亚胺-3[正丁基锡]苯甲酸酯法。2.最大耐受剂量（MTD）实验,该实验在荷HCT116结肠癌模型鼠上进行。3.描绘肿瘤生长曲线、记录裸鼠生存时间,并计算荷瘤裸鼠肿瘤体积倍增时间（VDT）及中位生存时间。4.流式细胞学检测治疗结束后各组肿瘤组织的CD133的表达。5.Western-blot检测治疗结束后各治疗组肿瘤组织中干细胞相关指标的表达,干细胞相关指标包括:CD133、ALDH1、Lgr5、E-cadherin、Vimentin、Snaill。6.Ki67染色反映治疗结束后肿瘤组织的增值情况,结果以增值指数来表示。7.治疗结束后各组肿瘤组织HE染色。8.生物分布实验,了解标记物在体内的药代动力学特性,并根据生物分布结果计算出肿瘤组织的辐射吸收剂量。结果1.荷HCT116结肠癌鼠的MTD为16.65 MBq。2.从肿瘤生长曲线可知,同一时刻131I-SIB-AC133.1 mAb组对应的裸鼠肿瘤平均体积小于其它三组,生理盐水组、131I-IgG1组、AC133.1 mAb组、131I-SIB-AC133.1 mAb组对应的肿瘤 VDT 分别为 6.29 ±0.78 d、6.42 ±0.35 d、6.89 ±0.30 d、9.36 ±0.45 d,131I-SIB-AC133.1 mAb组的VDT较其它三组延长（P<0.001）;生理盐水组的VDT与131I-IgG1、AC133.1 mAb 组相比无明显差异（对应为 P=0.494、P=0.062）,131I-IgG1组的VDT与AC133.1 mAb组相比无明显差异（P=0.167）。3.131I-SIB-AC133.1mAb组的生存率较其他三组延长（P<0.001）。生理盐水组、131I-IgG1组、AC133.1 mAb组及131I-SIB-AC133.1 mAb组对应的裸鼠中位生存时间分别为 27.8 d、29.4 d、32.6 d、44.0 d。4.流式细胞术检测生理盐水组、131I-IgG1组、AC133.1 mAb组及131I-SIB-AC133.1 mAb 组中肿瘤的 CD133 表达分别为 21.70±1.61%、20.12±1.46%、18.24 ±2.53%、7.15 ± 0.95%,131I-SIB-AC133.1 mAb 组 CD133 表达较其他三组降低（P<0.001）,生理盐水组CD133表达与131I-IgG1组、AC133.1 mAb组相比无明显差异（相应为P=0.366、P=0.056）,131I-IgG1组与AC133.1 mAb组的CD133表达相比也无明显统计学差异差异（P=0.237）。5.Western-blot 显示 131I-SIB-C133.1mAb 组 CD133、Lgr5、ALDHI、Vimentin、Snaill蛋白表达较其它三组下降,而E-cadherin蛋白表达较其他三组升高;其他三组干细胞相关指标表达相比未见明显差异。6.生理盐水组、131I-IgGl 组、AC133.1 mAb 组及 131I-SIB-C133.1 mAb 组对应的细胞增值指数分别为 41.56 ±2.52%、33.46 ±1.72%、28.60 ±2.88%、9.52 ±1.33%,131I-SIB-AC133.1 mAb组细胞增值指数低于其它三组（P<0.O00）;生理盐水组增值指数较 131I-IgG1 组、AC133.1mAb 组均高（对应为P=0.014、P=0.001）,131I-IgG1 组增值指数较 AC133.1mAb 组高（P=0.043）。7.131I-SIB-AC133.1 mAb组肿瘤组织HE染色显示有大片中央坏死区,而其他三组肿瘤组织内未见明显坏死。8.131I-SIB-AC133.1 mAb组肿瘤组织的平均辐射吸收剂量为5,966.34 ± 54.90 cGy。结论靶向结肠癌干细胞的RIT能抑制肿瘤生长。