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植物miRNA是一类参与植物防御反应和免疫应答的调控因子,它通过调节其靶基因的表达,提高植物抗各种病原菌侵染的能力。苹果斑点落叶病（Alternaria Blotch）和苹果轮纹病（Physalospora piricola Nose）均是我国苹果生产中的主要病害,在苹果种植地区严重影响果品的产量和品质,给果农造成重大的经济损失。目前针对该病害的分子生物学研究主要集中在植物抗病基因的发掘上,但是对于miRNA和靶基因互作影响斑点落叶病和轮纹病抗性的研究报道较少。已有报道发现,miR827响应缺磷胁迫保守性靶向SPX家族基因,在植物磷转运信号途径中发挥重要作用,miR397在植物生长发育及非生物胁迫中具有重要调控作用,但是有关其在果树病原菌防御响应的研究还未见报道。本研究以我国特有的优良抗病苹果种质资源-湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd]叶片为试材,利用qRT-PCR技术分析了 Mh-miR827及其靶基因响应苹果斑点落叶病菌的表达情况;利用RT-PCR技术克隆得到MhMIR827和MhSPX-MFS1并进行了相关生物信息学分析;通过5’RLM-RACE试验验证了Mh-miR827与MhSPX-MFS1/2的互作关系,通过农杆菌介导的烟草共转化试验进一步验证了 Mh-miR827与MhSPX-MFS1的互作机制;利用农杆菌介导的瞬时转化技术、qRT-PCR技术证明了 Mh-miR827和Mh-miR397b分别负调控湖北海棠和嘎啦对苹果斑点落叶病和轮纹病抗性。主要研究结果如下:1.通过生物信息学网站预测了 miR827的四个靶基因,利用实时荧光定量PCR技术分析了不同侵染时间Mh-pri-miR827、Mh-pre-miR827、Mh-miR827及其候选靶基因 MD06G1069900（SPX-MFS1）、MD04G1068900（SPX-MFS2）、MD04G1172700（WNK5）、MD07G1005800（UPF0235）相对表达情况。结果表明:Mh-pri-miR827、Mh-pre-miR827、Mh-miR827与其候选靶基因均响应斑点落叶病病原菌侵染,其中 Mh-pri-miR827、Mh-pre-miR827、Mh-miR827 和MhSPX-MFS1/2受病原菌强烈诱导,且MhSPX-MFS1/2两个基因呈现相同的响应趋势,而MhWNK5和MhUPF0235对病原菌的响应不显著且呈现严重的滞后性。Mh-miR827与MhSPX-MFS1/2的表达呈显著负调控关系,初步推断MhSPX-MFS1/2为Mh-miR827靶基因。2.从湖北海棠叶片中克隆获得MhMIR827和MhSPX-MFS1基因并进行相关生物信息学分析。结果表明:MhMIR827长度为452bp（包含Mh-miR827前体181bp）,与miRBase数据库中mdm-MIR827比对其前体中有两个碱基差异,且有一个差异碱基位于成熟体第12位碱基上。克隆得到包含靶位点的2222bp的MhSPX-MFS1基因,该基因包含2013bp的开放阅读框（ORF）,编码670个氨基酸残基,与金冠苹果基因组同源基因ORF区相比较,有7个差异碱基,基因序列相似度为99.65%。其编码蛋白具有5个氨基酸差异,相似度为99.25%。预测该蛋白相对分子质量分别为75.02 kD,理论等电点为7.76,具有SPX和MFS两个保守结构域,有10个明显疏水区和2个亲水区。系统进化树分析发现MhSPX-MFS1在不同物种间相对保守,与之亲缘关系最近的是苹果 MdSPX at4g22990-like基因。3.利用5’ RLM-RACE和农杆菌介导的烟草共转化法验证Mh-miR827与预测靶基因的互作关系。结果表明:MhSPX-MFS1/2被切割,且切割位置发生在Mh-miR827靶位点的第10到第11位碱基上,而MhWNK5和MhUPF0235不能被切割。农杆菌介导的烟草共转化试验结果显示OxMhMIR827可抑制OxMhSPX-MFS1-GUS基因的表达,但是不能抑制OxmMhSPX-MFS1-G US基因的表达,证明了 Mh-miR827可通过碱基互补配对的方式调控MhSPX-MFS1的表达。4.利用农杆菌介导的瞬时转化技术在湖北海棠和嘎啦叶片中过表达MIR82 7和MIR397b,荧光定量结果显示,瞬时转化能够有效地改变转化叶片中miR827、miR397b和对应靶基因的表达水平,苹果斑点落叶病和轮纹病接种后,与野生型和转化了空载的对照植株相比,过表达MIR827和MIR397b基因明显促进了叶片病斑的发展。同时构建STTM载体分别抑制内源miR827和miR397b基因表达,荧光定量结果显示,瞬时转化能有效改变转化叶片中miR827、miR397b和对应靶基因的表达水平,苹果斑点落叶病和轮纹病接种后,与野生型和转化了空载的对照植株相比,STTM827和STTM397明显抑制了叶片病斑的发展。同时与对照植株相比,过表达叶片MIR827和MIR397b的病原菌定殖系数较高,而在STTM827和STTM397叶片中的病原菌定殖系数较低,说明STTM827和STTM397通过抑制病原菌的生长提高湖北海棠和嘎啦对病原菌的抗性;测定湖北海棠和嘎啦中两个对照及OxMIR397b和STTM397中木质素含量,结果表明OxMIR397b中木质素含量显著低于两个对照,而STTM397中木质素含量显著高于两个对照。因此,Mh-miR827负向调控湖北海棠和嘎啦对苹果斑点落叶病抗性且进一步证明了 Mh-miR397b通过木质素合成相关途径负向调控湖北海棠和嘎啦对苹果轮纹病抗性。