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目的本研究通过构建H.pylori MEL-Hp27 cagA基因缺失菌株、菌体与胃癌细胞共培养及细胞转染实验,探讨H.pylori菌体及其CagA蛋白对胃癌细胞TPI表达的调控作用,为进一步揭示pylori感染促进胃癌发生发展的分子机制建立基础。方法1.H.pylori MEL-Hp27 cagA基因缺失菌株(Hp27 cagA-)的构建:①caagA基因打靶载体的构建:以H.pylori郑州分离株MEL-Hp27(Hp27 cagA+)基因组DNA为模板,扩增cagA基因两侧同源臂Fup和Fdown;以pNZ8110质粒为模板扩增氯霉素抗性基因片段Fcm;采用无缝克隆技术连接Fup、Fdown、Fcm及pBluescript Ⅱ SK(-)质粒构建打靶载体 pB1K-mutant-cagA;②cagA基因缺失菌株的构建:将打靶载体pB1K-mutant-cagA经电转化转入感受态H.pylori菌体中,通过同源重组获得cagA基因缺失菌株;③cagA基因缺失株的鉴定:提取cagA基因缺失株Hp27 cagA-和原始菌株Hp27cagA+的基因组DNA和菌体蛋白,通过PCR和Western blot分析鉴定caagA基因敲除效果。2.细菌与胃癌细胞共培养实验:①用Hp27 cagA+菌株分别与胃癌细胞AGS和 SGC-7901共培养 24 h,感染复数(Multiplicity ofinfection,MOI)分别为 50:1、100:1和200:1,检测胃癌细胞TPI mRNA表达水平。②分别用Hp27 cagA+和Hp27 cagA-菌株与胃癌细胞AGS和SGC-7901按MOI=200:1共培养6 h、12 h和24 h,检测胃癌细胞TPI mRNA表达水平。3.重组质粒pcDNA-cagA转染细胞实验:分别用重组质粒pcDNA-cagA和质粒pcDNA3.1(+)转染AGS细胞和SGC-7901细胞,于转染后72 h用qPCR检测细胞TPI mRNA表达水平,并用Western blot法检测cagA基因在胃癌细胞的表达。4.基因定点突变质粒pcDNA-cagA-BM、pcDNA-cagA-DM的构建及转染实验:①根据CagA蛋白的EPIYA-B和EPIYA-D酪氨酸磷酸化位点序列设计突变引物,利用突变引物和Phanta Max高保真DNA聚合酶对目标质粒pcDNA-cagA进行定点突变;提取突变质粒pcDNA-cagA-BM、pcDNA-cagA-DM,并进行 DNA 测序鉴定;②用 pcDNA-cagA-BM、pcDNA-cagA-DM、pcDNA-cagA 和pcDNA3.1(+)分别转染SGC-7901细胞,在转染后48h检测细胞中TPI mRNA表达水平。结果1.Hp27 cagA基因缺失菌株(Hp27 cagA-)的PCR和Western blot鉴定结果显示Hp27 cagA基因已敲除,cagA基因缺失菌株构建成功。2.细菌与胃癌细胞的共培养实验:①Hp27cagA+菌株与ACS和SGC-7901胃癌细胞共培养24h,结果显示:当MOI=50:1、100:1和200:1时,实验组TPI mRNA水平均较空白对照组显著上调(P<0.001),且TPI mRNA水平在MOI=200:1 时显著高于 MOI=100:1(P<0.001),MOI=100:1 时显著高于MOI=50:1(AGS:P<0.001;SGC-7901:P<0.01)。②Hp27 cagA+和caAA-菌株与AGS细胞以MOI=200:1共培养6 h时,cagA+组与cagA-组TPI mRNA表达较空白对照组均上调(P<0.01,P<0.001),cagA+组TPI mRNA表达较cagA-组TPI显著降低(P<0.01);共培养12 h和24h时,cagA+组和cagA-组与空白对照组相比TPImRNA表达水平均显著上调(P<0.001),同时cagA+组TPI mRNA水平高于cagA-组(P<0.001)。菌体与SGC-7901细胞以MOI=200:1共培养6 h时,cagA+组与cagA-组TPI mRNA表达水平高于空白对照组(P<0.001),cagA+组高于 cagA-组(P<0.01);共培养 12 h和 24h 时,cagA-组和cagA+组与空白对照组相比,TPI mRNA表达水平均显著上调(P<0.001),ccagA+组与cagA-组相比TPI mRNA表达水平上调(P<0.001)。3.pcDNA-cagA重组质粒转染细胞实验:用重组质粒pcDNA-cagA和质粒pcDNA 3.1(+)分别转染 AGS 和 SGC-7901 细胞,转染后 72 h 的 Western blot检测结果显示pcDNA-cagA转染成功;qPCR检测结果显示pcDNA-cagA组TPI mRNA表达水平显著高于pcDNA3.1(+)组(P<0.001)。4.定点突变质粒pcDNA-cagA-BM、pcDNA-cagA-DM的构建及转染实验:①对定点突变质粒进行测序,结果显示MEL-Hp27 CagA蛋白的EPIYA-B和EPIYA-D酪氨酸磷酸化位点突变成功;②用突变质粒pcDNA-cagA-BM/DM、重组质粒pcDNA-cagA和空质粒pcDNA 3.1(+)分别转染SGC-7901细胞,转染后48 h检测结果显示突变质粒pcDNA-cagA-BM/DM组TPI mRNA表达水平显著低于pcDNA-cagA组(P<0.001),与空质粒组无统计学差异(P=0.94,P=0.61)。结论1.H.pylori CagA具有调节胃癌细胞TPI表达的作用。由于TPI与多种肿瘤的发生发展密切相关,本研究发现提示CagA可能通过调节胃组织细胞TPI表达参与胃癌发展进程。2.H.pylor iCagA对胃癌细胞TPI表达的影响受酪氨酸磷酸化机制调节。3.H.pylori菌体与胃癌细胞的共培养时间和MOI影响胃癌细胞TPI表达水平。首次观察到在H.pylori菌体与胃癌细胞共培养时间不同时,H.pylori cagA基因可能对TPI的表达具有反向调节作用。4.研究发现cagA-菌株感染上调胃癌细胞TPI的表达,提示在H.pylori菌体中除CagA蛋白外尚存其它调节TPI表达的因子。