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研究设想:生命体的发育和稳固依赖于细胞存活、死亡和再生的平衡,而机体对于死亡细胞的清除是细胞更新换代的必然条件。常见的细胞死亡方式包括凋亡和坏死等,近年来一种新发现的以脂质过氧化物堆积为特征的程序性死亡方式——ferroptosis(铁死亡)受到了广泛关注。不同死亡方式的细胞有不同的清除机制,在一定程度上决定着机体的生理和病理的发展走向。目前的研究表明,凋亡细胞(apoptotic-cell)能够呈递促吞噬信号(“eat-me”和“find-me”signal)而被巨噬细胞清除。而发生坏死细胞(necrotic-cell)碎片会诱导炎性细胞迁移并在吞噬后诱发炎症反应。然而,对于发生ferroptosis的细胞是否能够被巨噬细胞清除的这一问题还不清楚。细胞发生ferroptosis时细胞膜会破裂,类似于坏死特征,同时ferroptosis又是由一系列酶促反应所调节,类似与apoptosis特征。由此我们提出科学问题:ferroptotic-cell可否被巨噬细胞所清除?如果可以,那么ferroptotic-cell被巨噬细胞识别的“eat-me”signal分子是什么?针对上述设想,本课题采用ferroptosis促进剂RSL3和apoptosis促进剂STS,分别诱导人早幼粒急性白血病细胞HL60和小鼠白血病细胞L1210发生ferroptosis和apoptosis,以此比较巨噬细胞对ferroptotic-cell和apoptotic-cell吞噬能力和方式的差异,并进而考察ferroptotic-cell清除的促吞噬信号。研究方法:1)探讨ferroptosis-cell是否能被巨噬细胞识别并清除:采用HL60细胞以及L1210细胞,给予RSL3和STS诱导细胞发生ferroptosis和apoptosis,同时给予Fer-1、DFO和VE等ferroptosis抑制剂来佐证此种死亡方式的特异性,采用CCK-8以及LDH释放试剂盒检测细胞存活率;采用流式细胞术和激光共聚焦技术检测巨噬细胞对两种死亡方式的细胞的吞噬情况:建立浓度依赖性的吞噬曲线,确定同吞噬率的两种死亡诱导剂的浓度;并利用GPX4诱导敲除Pfa1细胞模型验证ferroptotic-cell被吞噬情况。2)探讨这两种死亡方式的细胞的促吞噬信号的差异:选取RSL3和STS两种死亡诱导剂处理后吞噬率相等时的浓度作对比,并借助qRT-PCR、Western Blotting以及流式细胞术三种手段从基因、蛋白、脂质三个层面,考察目前已知的apoptotic-cell表达的促吞噬信号,包括ICAM3、GAS6、MFG-E8、CRT、PS以及抑吞噬信号CD47;并从ferroptosis关键指标脂质过氧化产物入手,采用流式细胞术以及激光共聚焦扫描显微术检测两种死亡方式的脂质过氧化程度的差异,以考察ferroptosis是否存在特异性促吞噬信号。3)基于LC-MS的脂质组学法检测ferroptotic-cell的细胞膜脂质过氧化程度和磷脂种类,并预先加入花生四烯酸(AA)或过氧化型1-硬脂酰-2-花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(SAPE-O-OH)干预脂质合成氧化途径,合并RSL3与STS进行孵育,采用流式细胞术检测并对比其被吞噬程度,以此阐述氧化型脂质对巨噬细胞识别和吞噬过程的作用。最后合成生物素化修饰的SAPE进行原位pull down实验,并以1-硬脂酰-2-花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(SAPE)为例,将ferroptoticcell的吞噬信号分子与已知的“eat-me”signal受体蛋白进行分子对接模拟,获取候选蛋白,进而,对候选识别吞噬信号的受体进行筛选与验证。研究结果:研究结果显示,RSL3和STS呈浓度依赖诱导HL60和L1210细胞分别发生了特异性死亡方式——ferroptosis和apoptosis。使用巨噬细胞与死亡细胞共培养、并对巨噬细胞进行特异性标记的多项实验结果表明ferroptotic-cell能够被巨噬细胞清除,类似apoptotic-cell。但我们后续研究发现ferroptotic-cell的吞噬信号“eatme”signal与apoptotic-cell的不同:经典吞噬信号ICAM3、GAS6、MFG-E8、CRT蛋白以及PS外翻在ferroptotic-cell中均无明显的变化。脂质过氧化是发生ferroptosis的细胞的关键步骤之一,而LC-MS结果进一步显示ferroptotic-cell细胞膜脂质的氧化程度具有种类特异性,以过氧化磷脂酰乙醇胺(PE-O-OH)的变化最为明显,最新的研究认为它是ferroptosis发生的标志分子。高不饱和度的HL60细胞(外源孵育AA),在给予RSL3诱导脂质过氧化发生后,其吞噬指数显著增加。此外,PE-O-OH能达到与RSL3同等的促吞噬效果。以上结果表明ferroptosis过程中脂质过氧化是影响吞噬最重要的原因之一,其中PE-O-OH是“eat-me”singal关键分子。为了进一步探讨识别该吞噬信号PE-O-OH的巨噬细胞受体,我们合成了生物素标记的SAPE通过质谱分析生物素化探针原位pull down的蛋白,并采用虚拟分子对接获取与SAPE高度相关的蛋白,将两者的结果对比后筛选出靶标蛋白TLR2。综上所述,本课题率先发现ferroptotic-cell细胞膜上的氧化脂质PE-O-OH作为“eat-me”signal能够促进巨噬细胞对ferroptotic-cell的清除,并初步筛选出相关的巨噬细胞受体TLR2,下一步研究我们将采用多种生物模型以及干预手段对这一机制进行深层探索。本课题有望为探究ferroptosis的机体清除机制奠定理论基础,在ferroptosis相关疾病中开发新药作用提供新的靶标,为理解ferroptosis这一新型的细胞死亡方式在机体的生理病理发展过程中的作用提供新的认识。研究结论:1)ferroptotic-cell能够被巨噬细胞识别并清除,但其吞噬机制与apoptoticcell的经典信号不同;2)ferroptotic-cell细胞膜上的PE-O-OH能够作为“eat-me”signal被巨噬细胞受体TLR2识别,以此诱导巨噬细胞对ferroptotic-cell的清除。