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骨髓中除含有生成各种血细胞的造血干细胞(hematopoietic stem cells;HSC) 外,还存在着一类具有多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymal stem cells; MSC),MSC 具有高度的自我更新能力,体外扩增能力极强,扩增后的 MSC 仍保 持其正常表型和端粒酶活性;MSC具有多向分化潜能,在体内、外特定培养条件下 可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、肝脏细胞和支持造 血的基质细胞等;MSC分泌多种细胞因子,如造血和非造血生长因子、趋化因子等, 调节骨髓微环境,促进自身及造血干细胞的增殖分化;MSC具有免疫调节能力,不 表达主要组织相容复合体(major histocompatibility complex;MHC)Ⅱ类分子和T 细胞共刺激分子B7,没有明显的免疫原性,并且抑制主要的和次要的混合淋巴细胞 反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR),具有免疫抑制性。大量研究表明MSC 与HSC共移植可促进HSC归巢植入,增强造血;减轻移植物抗宿主病(graftversus host disease,GVHD);重建骨髓基质,维持造血。此外,MSC 来源丰富,获取方 便,研究中很少涉及伦理学和法律问题,因此是干细胞移植中最佳的细胞来源之一。 虽然大量的实验研究已证实MSC可以促进自体或异体HSC移植后的造血重建 和减轻GVHD,但目前MSC移植还处于起步阶段,尚有许多问题亟待解决。例如, 最合适的 MSC 移植数量是多少?何时移植效果最佳?移植后植入率如何?植入后 是否仍保留多向分化潜能?这些问题均有待进一步探讨。 针对如上现状,本课题拟解决以下几个主要问题:(1)分离人骨髓MSC进行 大规模培养扩增,研究培养扩增后的MSC的生物学特性并进行相关的安全性检测, 建立 MSC 大规模培养扩增的技术平台。(2)应用细胞培养体系,观察 MSC 作为 滋养层体外对人脐带血(umbilicalcordblood,UCB)CD34+细胞的支持作用,证实 大规模培养扩增的MSC具有体外支持造血作用。(3)应用NOD/SCID鼠HSC移 植模型,证实MSC对UCBCD34+细胞植活的促进作用,明确MSC和HSC共移植 的最适剂量和移植时机,提出临床实施方案。 第一部分:人骨髓间充质干细胞体外大规模培养及其生物学特性研究 方法:抽取健康成人志愿者髂后上棘骨髓20ml,以密度为1.073g/ml 的Percoll 分离液 分离骨髓单个 核细 胞(MNC) , 加入内含 2mM L- 谷氨 酰胺的 10%FBS/DMEM-LG 培养液,以 175cm2的塑料培养皿进行大规模培养扩增;培养扩 增的MSC常规液氮方法冻存6个月,复苏后,与持续体外培养的MSC进行相应代 数(passage,P)的如下检测:显微镜下观察细胞形态特点;计数法绘制细胞生长 曲线;FACS 检测细胞周期和表面标志;成骨、成脂肪和成软骨鉴定其多向分化潜 能;培养液进行细菌、真菌、支原体和衣原体的病原学检测;应用染色体R显带技 术检测培养扩增的MSC细胞遗传学稳定性;裸鼠皮下注射MSC检测成瘤性。重复 3 次的实验结果,以 SPSS 统计软件之χ2检验、t 检验和单因素方差分析进行统计学 3PDF 文件使用 "pdfFactory" 试用版本创建 www.fineprint.com.cn<WP=7>第二军医大学博士研究生学位论文 中文摘要 处理。 结果:冻存复苏后与持续体外培养的 MSC 形态均为长梭形的成纤维细胞样; 具有高度的增殖能力,在体外能大量扩增,20ml骨髓获得的MSC,传代培养至P3 代,即可获得(4.41-5.04)×108的MSC;P1、P3、P7和P10代细胞周期检测显示 贴壁细胞中的G0/G1占(89±0.86)%,S+G2+M期占(10.77±1.25)%;各代MSC 不表达造血细胞表面标志,如CD34、CD45、CD14,也不表达与免疫排斥发生密切 相关的 CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、CD40L(CD154) 和 MHC-Ⅱ类抗原 HLA-DR,MSC 主要表达 CD29、CD44、CD90、CD105、CD166 和 MHC-Ⅰ类抗原 HLA-ABC,P3 至 P10 代 MSC 细胞均一性可达到 98%以上;在体外诱导培养下, MSC 可分化为成骨、脂肪和软骨细胞,具有多向分化能力。结果表明大规模培养扩 增的MSC不仅纯度高、生物学特性稳定,而且冻存复苏后的MSC与持续体外培养 的MSC在所有生物学特性上无差异。P10代MSC染色体检测无异常改变、裸鼠背 部皮下种植6个月未见肿瘤形成,各代细胞培养上清的细菌、真菌、支原体和衣原 体检查均阴性,说明培养扩增的MSC可安全地用于体内。 第二部分:人骨髓间充质干细胞体外支持造血作用 方法: Coγ射线照射贴壁培养的 MSC 和对照的成纤维细胞样人骨髓基质细 60 胞系HFCL(Humanbonemarrowfibroblastoidstromalcelllineage ,HFCL),照射剂量 1 500cGy,照射剂量率为 20cGy/min,制备细胞滋养层。免疫磁珠法(magnetic cell sorting system,MACS)分离 UCBCD34+细胞。(1)根据滋养层细胞不同和是否添 加细胞因子(50ng/ml rhFL 、50ng/ml rhSCF、20ng/ml rhTPO)将实验分为六组: ①Control组:无细胞因子和滋养层。②Cyto组:单纯细胞因子,无滋养层。③HFCL 组:单纯HFCL滋养层。④MSC?