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目的:阿尔茨海默病(Azheimer’s disease,AD)是一种复杂的神经系统变性疾病,发病机制尚不明确,目前治疗只能缓解部分患者的症状,并不能控制疾病的发展进程。近年来越来越多的学者发现氧化应激发生于AD早期,如果通过早期的抗氧化治疗,有可能控制AD的发生和发展。临床研究发现当归芍药散能减轻部分AD患者的病情,我们通过药效筛选,发现方中君药白芍的活性成分芍药苷(PF)有抗氧化作用,因此本课题对其作用机制进行假设:PF可能通过调节受氧化应激损伤的PC12细胞的IGF-1/Akt/PGC-1α这一障碍的信号通路,保护损伤的PC12细胞,提高细胞中线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),减少氧化损伤,并抑制毒性物质的沉积,从而起到一定的抗氧化抗凋亡作用。因此本课题对芍药苷调控的IGF-1/Akt/PGC-1α信号通路进行研究,从分子机制角度探讨PF对神经细胞凋亡的抑制作用,为当归芍药散以及芍药苷治疗AD提供实验依据。具体方法如下:方法:先建立氧化损伤的细胞模型,通过MTT法和流式细胞技术检测细胞存活率和凋亡率从而确定给药浓度;筛选芍药苷的给药浓度;接着通过分组,造模,给药,最后检测三个氧化指标和IGF-1/Akt/PGC-1α通路蛋白表达水平。1.芍药苷对H2O2损伤PC 12细胞的保护作用采用噻唑蓝(MTT)法筛选H2O2造模的最佳损伤浓度,同时检测芍药苷对PC12细胞的增殖作用,最后检测PF(100μmol·L-1、200 μmol·L-1)对H2O2损伤的PC12细胞活力的影响。将细胞分为正常组、模型组、PF 100 μmol·L-1组和PF、200μmol·L-1组,造模给药24h后,通过倒置显微镜下观察各组细胞形态学;Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率;JC-1荧光探针检测试剂盒检测细胞线粒体膜电位;用试剂盒和酶标仪检测细胞中各氧化指标,包括超氧化物歧化酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)。2.芍药苷对H2O2损伤细胞的IGF-1/Akt/PGC-1α通路蛋白水平的影响将细胞分为正常组、模型组、PF 100μmol·L-1组和PF、200μmol·L-1组,造模给药 24h 后,用 Western blot 检测各组 IGF-1、IGF-1R、Akt、p-Akt、PGC-1α 的表达水平。结果1.芍药苷对H2O2损伤PC12细胞的保护作用H2O2浓度筛选结果为8 μmol·L-1;各浓度芍药苷对正常PC12细胞没有显著增殖作用,但略有提高细胞数量;氧化应激模型造模方法采用8 μmol·L-1 H2O2造模1h,显微镜下观察,大量细胞中部鼓起有圆形光点、突触断裂,即可弃去H2O2造模液,给予含100 μmol·L-1、200 μmol·L-1的芍药苷培养基。8 μmol·L-1 H2O2细胞存活率达到65.00%,H2O2浓度越高,细胞存活率越低,而H2O2浓度高于100 μmol·L-1的细胞组几乎没有细胞存活。不同浓度PF的对PC12细胞无显著增殖和抑制作用,但细胞存活率均略有提高。细胞形态学结果显示:与正常组相比,模型组可见大部分细胞胞突起断裂,与细胞体分离,呈梭形或圆点状分布,畸形的细胞折光性下降,培养液脱壁细胞增多,贴壁的活细胞数量减少;给予PF培养24h,进行损伤修复,发现随着药物浓度的增加,PF各给药组具有完整结构的细胞增多,突起重新长出,梭形明显,脱壁细胞减少。细胞凋亡率结果显示:与正常组比较,模型组PC12细胞凋亡率增加了 4倍,差异有统计学意义;与模型组比较,用PF(100、200 μmol·L-1)处理后降低了细胞的凋亡率(细胞凋亡率分别为38.07%、35.13%),差异均有统计学意义。细胞线粒体膜电位结果显示:正常组细胞出现强红色的荧光,几乎不可见的绿色荧光,而模型组细胞红色荧光强度大大减弱,绿色荧光增强,红/绿荧光比值大幅下降(P<0.01)。芍药苷(100、200μmol·L-1)干预后,红色荧光逐渐增强,绿色荧光减弱,红/绿荧光比值与模型组对比,显著提高。与正常组比较,H2O2模型组PC12细胞内SOD活力和T-AOC明显降低,而MDA含量高于正常对照组,差异均有统计学意义;与模型组比较,不同浓度PF组均能提高细胞内SOD活力和T-AOC,差异均有统计学意义,且200 μmol·L-1PF组还能减少MDA含量,差异有统计学意义,并呈一定的剂量依赖性。2.芍药苷对H2O2损伤细胞的IGF-1/Akt/PGC-1α通路蛋白水平的影响与正常组比较,模型组IGF-1、IGF-1R、Akt、PGC-1α蛋白水平显著下调;与模型组比较,芍药苷干预后,IGF-1、IGF-1R、Akt、p-Akt和PGC-1α蛋白相对表达水平明显上调,并且p-Akt蛋白的磷酸化水平显著提高。结论1.芍药苷能够提高细胞存活率和降低细胞凋亡率,改善细胞形态,通过提高细胞线粒体膜电位和抗氧化应激能力,从而起到促存活的保护作用。2.芍药苷通过调节IGF-1因子,激活IGF-1受体,从而影响下游通路AKT的磷酸化和PGC-1α的表达。综上,芍药苷可能通过IGF-1/AKT/PGC-1α通路起到抗氧化抗凋亡的作用。