论文部分内容阅读
背景:脑积水(external hydrocephalus,EH)是临床常见颅脑疾病,严重影响到患者生活质量,成为沉重的家庭与社会负担。脑积水一旦形成,致残率很高。目前脑积水的临床治疗手段大多仅能缓解症状,并不能彻底治愈,因此,脑积水的治疗是神经病学科的一大难题。各种类型脑积水的共同原因是蛛网膜下腔纤维增生,粘连,软脑膜纤维化是其主要病理改变,主要表现为脑膜间皮细胞(meningeal mesothelial cells,MMCs)大量增殖以及细胞外基质的堆积。原代脑膜间皮细胞分离困难,体外培养要求条件较高,传代难度大,传多代后细胞贴壁率大幅下降,这些缺陷给体外研究带来困难,成为阻碍脑膜间皮细胞相关研究的重要技术难题。因此,体外培养脑膜间皮细胞并建立永生化细胞系可为脑膜相关疾病的研究提供方便可靠的细胞模型,对于了解脑膜间皮细胞在脑膜纤维化中的作用和功能意义重大。同时,有关脑膜纤维化的研究大多局限于影像学和组织学层面,对其分子水平的发病机制研究甚少。引起器官纤维化的细胞因子众多,近年来研究较广泛、深入的是TGF-β1(transforming growth factor-beta 1,转化生长因子-β1)。有研究结果证实,TGF-β1可引起脑膜间皮细胞CTGF(connective growth factor,结缔组织生长因子)的m RNA和蛋白表达上调,促使脑膜间皮细胞增殖并合成多种胶原等细胞外基质,导致脑膜纤维化的形成,因此阻断TGF-β1通路对抑制脑膜纤维化具有重要意义。但因TGF-β1还具有免疫调节和抑制炎性反应等重要生理功能,使直接阻断TGF-β1的治疗缺乏临床可行性,故应找寻TGF-β1下游新的治疗靶点以单纯阻断TGF-β1促纤维化的过程。p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase,p38丝裂原活化蛋白激酶)和ERK/MAPK通路(mitogen-activated protein kinases,MAPKs,丝裂原活化蛋白激酶;extracellular signal-regulated kinase,ERK,细胞外信号调节激酶)是信号转导的两条重要通路,有学者证明在多种细胞,如肺成纤维细胞,肾系膜细胞及肾成纤维细胞中p38信号通路和ERK/MAPK都可介导TGF-β1诱发的纤维化,但是两者是否参与TGF-β1对脑膜间皮细胞纤维化的诱导并不清楚。本课题尝试建立大鼠脑膜间皮细胞永生化细胞系并以外源TGF-β1为刺激因子建立体外脑膜纤维化的细胞模型,从基因转录和蛋白合成两个方面探讨p38MAPK和ERK/MAPK信号通路在TGF-β1诱导脑膜间皮细胞纤维化的具体作用,试图为脑积水的防治寻到有效的干预位点。目的:1.建立大鼠脑膜间皮细胞永生化细胞系。2.以TGF-β1为刺激因子建立体外脑膜纤维化的细胞模型,观察RMMCs中有无参与组织纤维化的p38 MAPK及ERK/MAPK的表达,并应用p38MAPK特异性抑制剂SB203580、ERK/MAPK的抑制剂U0126处理细胞,观察CTGF的表达,探讨脑膜纤维化的发生机制,为今后防治脑膜纤维化寻求有效的靶点。方法:1.大鼠原代脑膜间皮细胞的分离和培养:用胰酶消化组织块法收集大鼠原代脑膜间皮细胞;2.构建表达SV40LT的慢病毒载体并转染大鼠脑膜间皮细胞;3.应用扫描电镜、细胞免疫荧光化学、RT-PCR等技术从细胞形态、特异性标志物、目的基因的表达等方面对野生及转染SV40LT后的大鼠脑膜间皮细胞进行鉴定。4.用不同浓度的TGF-β1分别孵育培养RMMCs 24 h,采用q PCR测定CTGF的相对表达量,采用Western blotting测定p-p38MAPK、p-ERK1/2的信号强度;预先用不同浓度的SB203580或U0126处理RMMCs,观察TGF-β1诱导的CTGF表达是否受影响。采用q PCR测定CTGF m RNA的相对表达量,采用Western blotting测定CTGF蛋白质表达水平。结果:1.体外成功培养大鼠原代脑膜间皮细胞。分离培养的RMMCs在倒置显微镜下观察:细胞为多边形,汇合时呈铺路石样排列;扫描电镜下可见细胞表面有大量密集突起的绒毛;免疫细胞化学鉴定结果显示RMMCs抗波形蛋白抗原阳性,抗细胞角蛋白抗原阳性,抗第VIII因子相关抗原阴性,流式细胞术检测培养细胞的纯度达90%以上。2.构建含SV40LT基因的慢病毒表达载体,并成功转染RMMCs。转染后挑选单克隆RMMCs鉴定,扫描电镜下可见细胞表面有大量密集突起的绒毛;免疫细胞化学鉴定结果显示抗波形蛋白抗原阳性,抗细胞角蛋白抗原阳性,抗第VIII因子相关抗原阴性;RT-PCR鉴定目的基因SV40LT成功整合入RMMCs基因组。3.TGF-β1可诱导体外RMMC细胞发生纤维化,表现为纤维化标志物CTGF表达水平的显著增加;4.TGF-β1以浓度依赖的方式诱导脑膜间皮细胞中p38 MAPK通路的活化,SB203580可阻断TGF-β1对该信号通路的活化,并强烈抑制纤维化标记物CTGF的表达。SB203580预处理细胞后,再应用TGF-β1刺激,CTGF的诱导表达几乎被完全抑制。5.TGF-β1以浓度依赖的方式诱导脑膜间皮细胞中ERK/MAPK通路的活化。U0126可阻断TGF-β1对该信号通路的活化,但纤维化标志物CTGF的诱导表达不受影响。结论:1.经SV40LT的慢病毒载体成功建立RMMCs永生化细胞系。2.TGF-β1可通过激活p38 MAPK通路促进体外培养的脑膜间皮细胞CTGF表达。TGF-β1活化p38 MAPK通路促进CTGF表达是其致脑膜纤维化的重要机制之一。3.TGF-β1可以诱导细胞中ERK/MAPK通路的活化,但ERK/MAPK通路不参与TGF-β1致脑膜纤维化的过程。4.TGF-β1可通过多种途径促进体外培养的脑膜间皮细胞CTGF表达。