昆虫作为低等的节肢动物,不具备高等动物所具有的获得性免疫系统,它们依赖先天性免疫应答机制来识别、应对入侵和损伤。昆虫免疫系统包括细胞免疫和体液免疫两个部分,细胞免疫主要是基于血细胞的一些防御反应,包括吞噬、结瘤和包囊等；体液免疫主要包括抗菌肽的生成,凝集反应和黑色素的形成。在酚氧化酶级联反应中,一系列丝氨酸蛋白酶被连续的激活,初始信号级联放大并激活最终的蛋白酶——前酚氧化酶激活蛋白酶。被激活的前酚氧化酶激活酶激活前酚氧化酶产生有活性的酚氧化酶,酚氧化酶能催化酚氧化产生联苯醌,最终形成沉积于微生物和血细胞表面的黑色素。烟草天蛾(Manduca sexta)酚氧化酶原激活系统研究的比较透彻。作为起始的免疫应答蛋白酶,血淋巴蛋白酶M.sexta HP14在接收上游信号后可以自发激活,进而引起下游通路中的蛋白酶激活。家蚕(Bombyx mori)的酚氧化酶级联反应研究的比较早,但是目前在家蚕中还没有关于酚氧化酶原激活系统的起始蛋白酶研究的相关报道。本研究首先通过信息学分析在家蚕EST数据库中检索获得与烟草天蛾血淋巴蛋白酶HP14同源性的基因序列,通过基因克隆和RACE技术得到家蚕血淋巴蛋白酶HP14(BmHP14)基因的全长cDNA片段并分析了该基因的结构；通过RT-PCR技术分析了该基因的组织表达谱；用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在受到黑胸败血芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和球孢白僵菌(真菌)侵染后的表达情况；原核表达并纯化了BmHP14融合蛋白,制备了BmHP14抗体；通过Western blotting技术检测了BmHP14在受到革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌侵染后蛋白水平的表达情况。本研究的主要结果如下：1、家蚕BmHP14基因的全长cDNA克隆及序列分析通过生物信息学分析,在家蚕基因组数据库中筛选得到一个与烟草天蛾MsHP14基因同源的基因组片段,在此基础上结合EST数据,采用分子克隆和5’RACE、3’RACE技术得到该基因的全长cDNA序列,命名为BmHP14(Genbank NO. JQ954757)。序列分析发现,家蚕BmHP14基因具有17个外显子,16个内含子。通过在线软件分析发现BmHP14编码的蛋白质为一个理论等电点5.09,分子量71kDa的蛋白质。使用SignalP3.0Server分析发现前17个氨基酸为信号肽序列。对基因5’端序列分析发现,上游存在着包括NF-κB、GATA等转录因子的调控位点。通过将家蚕、烟草天蛾、黄粉虫、果蝇的丝氨酸蛋白酶基因进行多重序列比对分析发现,家蚕BmHP14与烟草天蛾MsHP14有高度的保守性。烟草天蛾的MsHP14在酚氧化酶级联反应中作为最先激发的丝氨酸蛋白酶对下游的信号通路起到关键作用,因此推测家蚕BmHP14可能作为家蚕酚氧化酶级联反应中的最先激发的丝氨酸蛋白酶。2、家蚕BmHP14基因的表达分析提取家蚕5龄3天各组织cDNA, RT-PCR检测靶标基因的表达情况,分析显示BmHP14基因在脂肪体、马氏管、精巢、卵巢、表皮、血细胞和头中有表达,其中在脂肪体中表达量最高。用革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌侵染5龄3天的家蚕后,提取家蚕脂肪体组织的cDNA。用RT-PCR和荧光定量PcR检测BmHP14基因的表达情况,分析显示家蚕BmHP14基因在受到病原菌侵染时,诱导表达上升。3、家蚕BmHP14抗体的制备及检测构建pET28a-His-BmHP14原核表达载体,在大肠杆菌中大量诱导表达,并纯化获得重组BmHP14蛋白。将重组BmHP14蛋白免疫成年新西兰公兔,制备多克隆抗体。并用Western blotting检测革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌对5龄3天的家蚕侵染后血淋巴中BmHP14蛋白的分布情况。检测结果显示革兰氏阳性菌侵染后,BmHP14蛋白在诱导3小时后表达上调,6小时后表达量降低,12小时后表达量升高直到24小时表达量保持较高水平。革兰氏阴性菌侵染家蚕后,从诱导1小时开始BmHP14蛋白表达上调,到24小时一直保持表达较高水平。家蚕受到真菌侵染后,1小时后表达上调,之后表达量逐渐降低到24小时表达量已经较弱。病原菌诱导刺激实验证明血浆中的BmHP14会在诱导后1小时、3小时上调,表明家蚕在受到外源病原菌刺激后,脂肪体会快速响应这种刺激后并上调BmHP14的转录、表达,然后释放BmHP14到血浆中,进而使得家蚕体液产生黑化反应以抵御病原菌对机体的影响。