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目的:在哺乳动物睾丸中,位于生精上皮基底膜（BM）附近的血睾屏障（BTB）对精子发生至关重要。BTB由相邻的支持细胞（Sertoli细胞）连接而成,将生精上皮分为靠近基底膜的“基底室”和靠近生精小管管腔的“近腔室”,为精子发生提供了免疫屏障。BM主要由Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白、肝素糖蛋白和巢蛋白组成。Ⅳ型胶原蛋白是基底膜的重要组成成分,啮齿类动物的睾丸中Ⅳ型胶原蛋白主要是由3条α3链组成的三螺旋结构。基底膜中的胶原蛋白可由金属蛋白酶（MMPs）水解并释放多种生物活性物质（如肿瘤抑素、内皮抑素、血管生成抑制因子等）,这些物质通过靶细胞膜表面的整合素受体参与调节细胞增殖、粘附及凋亡等过程。大鼠睾丸的Ⅳ型胶原蛋白α3链C端可以在MMP-9作用下水解成大小为28k Da的蛋白片段,称为C端非胶原结构域（NC1）片段。研究表明,应用重组NC1蛋白处理大鼠原代Sertoli细胞可以导致Sertoli细胞-细胞界面紧密连接（TJ）和基底胞外特化结构（basal ES）相关蛋白分布异常,从而影响BTB功能;后续研究结果表明,大鼠睾丸注射NC1过表达质粒可引起BTB屏障功能被破坏以及生殖细胞从生精上皮脱落,此过程涉及细胞骨架的异常排布和紧密连接相关蛋白分布异常。然而,NC1影响BTB功能及精子发生的具体分子途径尚不明确,本研究旨在探讨NC1影响Sertoli细胞功能及调节BTB通透性的具体机制,同时在大鼠生精障碍模型中探索NC1在精子发生异常过程中可能发挥的作用。方法:1、NC1过表达质粒转染体外培养大鼠原代Sertoli细胞,免疫印迹和免疫沉淀检测Rho A、Cdc42的表达水平和活性。2、NC1过表达质粒和/或失活型Cdc42T17N转染Sertoli细胞,进行如下实验:（1）免疫印迹和免疫沉淀检测Cdc42的表达水平和活性,于不同时间点测定Sertoli细胞跨上皮电阻（TER）;（2）免疫印迹检测基底胞外特化结构和紧密连接相关蛋白以及相关信号蛋白;（3）免疫印迹和免疫荧光检测肌动蛋白调节蛋白的表达及分布;（4）应用体外actin聚合试验和体外F-actin成束试验检测F-actin的成束和聚合能力;（5）免疫印迹和免疫荧光观察微管组织排布与微管调节蛋白的表达分布;（6）应用体外tubulin聚合试验和MT/tubulin超离试验检测微管聚合能力。3、使用NC1过表达质粒转染体外培养大鼠原代Sertoli细胞,加入Akt1/2特异性激活剂SC79后,通过免疫沉淀和免疫印迹检测Cdc42活性,通过免疫荧光和免疫印迹检测连接蛋白、相关信号通路蛋白、微丝和微管及相关调节蛋白的分布与表达。4、应用不同浓度的化疗药物白消安构建大鼠生精障碍模型:（1）通过HE染色检测各组生精小管形态学改变;（2）通过生物素法检测白消安诱导的大鼠生精障碍模型是否伴有BTB屏障功能受损;（3）运用免疫印迹方法检测大鼠生精障碍模型中MMP-9、NC1、Akt、p-Akt及Cdc42-GTPase水平;（4）通过免疫荧光检测大鼠生精障碍模型中NC1、β1-整合素、层粘连蛋白-γ3、ZO-1、occludin、MT、F-actin的分布情况。5、向白消安生精障碍模型大鼠睾丸内注射MMP-9抑制剂JNJ0966,同时设置NC1过表达质粒睾丸内转染组,（1）免疫印迹检测MMP-9活性及NC1水平变化;（2）HE染色观察生精过程变化;（3）生物素法检测BTB通透性;（4）睾丸组织冰冻切片免疫荧光观察连接蛋白分布及F-actin、微管骨架排布改变;（5）F/G actin超离试验和MT/tubulin超离试验分别检测各组睾丸组织actin及微管蛋白的聚合能力。结果:1、NC1过表达可上调Cdc42 GTPase活性,且失活型Cdc42 T17N能够抑制NC1过表达引起的体外Sertoli细胞屏障功能下降。2、NC1过表达通过Cdc42活化影响大鼠原代Sertoli细胞连接蛋白（occludin、CAR、ZO-1、N-cadherin、β-catenin）分布,但不影响其表达,失活型Cdc42 T17N能抑制NC1过表达引起的连接蛋白分布变化。3、NC1过表达可活化rp S6同时抑制Akt,且失活型Cdc42 T17N对该作用无显著影响。4、NC1过表达可下调F-actin成束蛋白Eps8水平,且失活型Cdc42T17N能抑制该作用及NC1过表达引起的F-actin分布改变,亦可拮抗NC1过表达引起的F-actin成束能力和聚合能力减低。5、NC1过表达可下调微管调节蛋白EB1水平,失活型Cdc42 T17N能抑制该作用及NC1过表达引起的微管相关蛋白分布改变,同时抑制NC1过表达引起的tubulin聚合能力减低。6、SC79可抑制NC1过表达引起的Cdc42的活化及连接蛋白分布改变。7、SC79可抑制NC1过表达引起的Sertoli细胞F-actin及MT骨架组织得异常排布。8、成功构建白消安诱导的大鼠生精障碍模型,发现该生精障碍模型伴有BTB屏障功能损伤。9、低剂量白消安诱导大鼠生精障碍模型中NC1和活性MMP-9水平显著增加。10、低剂量白消安诱导的大鼠生精障碍模型中NC1、β1-integrin、laminin-γ3、ZO-1、occludin、MT、F-actin分布异常。11、MMP-9特异性抑制剂JNJ0966可显著降低白消安生精障碍模型中的NC1水平,并缓解低剂量白消安诱导的生精障碍及BTB损伤。12、JNJ0966可缓解白消安生精障碍模型中大鼠生精小管连接蛋白（laminin-γ3、ZO-1）及F-actin、MT细胞骨架组织分布异常,且该作用可被睾丸内转染NC1过表达质粒所拮抗。13、JNJ0966可缓解白消安生精障碍模型中睾丸组织的F-actin及微管聚合能力减低,且该作用可被睾丸内转染NC1过表达质粒所拮抗。结论:1、NC1可通过下调Akt通路活性活化大鼠Sertoli细胞Cdc42,并由此改变Sertoli细胞的连接蛋白分布,同时通过下调Eps8及EB1水平影响F-actin及MT组织排布,进而调节Sertoli细胞屏障功能。2、白消安所致大鼠生精障碍模型同时伴有BTB功能损伤及NC1水平升高,抑制MMP-9活性可以通过降低NC1水平改善BTB连接蛋白及睾丸组织F-actin、MT的聚合与分布,由此缓解低剂量白消安引发的BTB功能损伤及生精障碍。