目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的一种原发恶性肿瘤,其患者总体发病率约占全部脑恶性肿瘤的40%-60%。胶质瘤划分为四个不同的级别,其中以IV级的胶质母细胞瘤（GBM）的各种恶性程度最高。目前对于包括GBM在内的胶质瘤,临床上最主要的治疗方法包括两方面:即最大范围进行手术切除,及同时术后采用标准的放疗和化疗。多数患者在即使在这种治疗情况下,也容易出现肿瘤复发且预后不良。考虑到胶质瘤复杂的特异性和极强侵袭能力以及传统的手术和放化疗等药物治疗方法对其效果有限的现实,充分研究胶质瘤在肿瘤中发生和发展的分子机制对理解该癌症的起因和改善其治疗效果有重要的意义。微小RNA（microRNA）是由约21-23个核苷酸序列组成的内源性的一类小的非编码RNA,它们通过与m RNA的3’非编码区进行特异性结合,在转录后调控进而促进或抑制靶基因的表达。已有大量的相关研究证明miRNA是肿瘤发生发展的重要调控因子,可以通过促进肿瘤细胞的增殖、侵袭等行为,起到明确的促癌作用。由于miRNA其作用机制非常复杂,在下游调控中通常可以影响多个信号通路,因此其影响机制也同样并不为线性的单一调控。同miRNA类似,长链非编码RNA（lncRNA）在细胞调控过程中位于更上游,可以起到广泛而复杂的影响。本课题研究的LINC00473,也称为6号染色体开放阅读框176（C6orf176）,是位于6q27号染色体上的lncRNA,参与突触活性调控的基因表达。多项前期研究结果提示,LINC00473的过度表达与包括肝细胞癌,乳腺癌,食道鳞状细胞癌,大肠癌,神经胶质瘤,骨肉瘤,胰腺癌,胃癌,宫颈癌,粘液表皮样癌和头颈部鳞状细胞癌和胆管癌等在内的许多人类恶性肿瘤有关。我们的课题组之前的研究发现,LINC00473在胶质瘤中表达水平高于瘤周组织（NBT）,并且可以参考作为独立评估高级别胶质瘤患者的预后的指标。同时通过后续的细胞功能学实验证实,lncRNA可以通过调控ATG系列蛋白介导细胞自噬功能。本次课题研究项目的主要目的是为了深入揭示LINC00473在临床调控恶性胶质瘤的生物学行为中所可能发挥的重要作用并进一步研究探索其临床效果和药物作用转化机制,为胶质瘤的早期临床诊断和早期治疗提供新的临床分子靶点和标志物。研究方法:1、样本收集及数据下载:本研究收集我院神经外科自2018年7月-2019年12月手术切除的80例胶质瘤组织标本（其中GBM50例）和10例瘤周组织（NBT）,所有肿瘤组织均由术后病理证实。胶质瘤样本临床数据及lncRNA、miRNA、m RNA数据均来自于TCGA网站（https://cancergenome.nih.gov/）及CGGA网站（http://www.cgga.org.cn/）下载,其中同时拥有lncRNA及m RNA表达信息的组织样本纳入本次研究,其中胶质母细胞瘤样本（GBM）519例,非肿瘤脑组织样本10例。所有临床数据进行分组并根据相应基因表达情况分组,进行临床分析。2、细胞培养、转染:人脑胶质瘤细胞系（U251,A172,U87和SHG44）来自ATCC。将细胞与含有10%胎牛血清的RPMI-1640（Invitrogen）在37℃,5%CO2培养箱中培养。pcDNA3.1-LINC00473、hsa-miR-210-3p模拟物和阴性对照品（NC）购自Gene Pharma（中国上海）。使用Lipo3000（Invitrogen）转染细胞并构建稳定转染细胞系,Opti-MEM无血清培养基培养。倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达水平,评估转染效率,qRT-PCR定量检测转染效率,western-blot检测蛋白表达水平。3、通过TRIZOL法从样本中提取总的RNA,使用相应的miRNA反转录试剂盒与m RNA试剂盒合成c DNA后,使用SYBR GREEN法检测lncRNA、miRNA、m RNA的表达丰度。U6作为miRNA检测时的内参,GAPDH作为m RNA检测时的内参。4、划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力的改变。5、Transwell侵袭实验检测肿瘤细胞侵袭能力的改变。6、细胞免疫荧光检测肿瘤细胞中目的蛋白的表达水平。7、蛋白免疫印迹用于检测蛋白表达水平的改变。8、双荧光素酶报告实验检测LINC00473与ATG7及miR-210-3p的靶向结合。9、统计分析:用spss22.0统计软件分析全部数据。测定结果以平均值±标准差表示。采用t检验或方差分析对各组间的显著性差异进行分析。结果:我们通过TCGA和CGGA比较了不同组（IDH1突变体或野生型）中LINC00473的表达,发现在IDH1野生型组中,LINC00473的表达高于突变体（P=0.007）。此外,我们还利用CGGA数据集,根据IDH1状态分析LINC00473的表达与WHO不同分级之间的关系。结果表明,在WHO IV级组中,LINC00473在野生型组中的表达高于突变型组（P<0.001）,LINC00473在老年患者中高表达（P=0.007）。以上结果提示LINC00473可能参与胶质瘤的进展。利用pcDNA3.1-LINC00473进行转染构建LINC00473的过表达细胞系,并通过PCR检测证明成功构建了LINC00473过表达细胞系（分别为U251和U87）。对上述细胞系进行CCk8分析,及通过划痕实验及Transwell实验证实LINC00473能明显促进胶质瘤细胞的增殖。进行FISH分析以观察LINC00473的位置,结果表明,它主要分布在细胞质中。LINC00473促进胶质瘤细胞自噬:进行western-blot分析以检测两种细胞系中LC3的表达,用免疫荧光法评估LC3脂化状态。结果提示与pcDNA3.1相比,LINC00473过表达细胞中的LC3II/LC3I比率显示出较高的值,免疫荧光也证实了相同的结果。LINC00473通过ATG7促进自噬:通过转染pcDNA-LINC00473来修饰LINC00473的内源性表达,进行PCR检测提示ATG7 m RNA的表达增强。随后,通过CGGA数据集,我们比较了ATG7在组织中的表达,结果表明野生型组ATG7表达高于突变型组（P=0.00017）。此外,WHO IV级野生型组中ATG7的表达远高于突变体（P=0.0024）,并且与年龄呈正相关（P=0.039）。另外,用western-blot分别检测U251和U87中ATG7的蛋白表达,用Image J对ATG7的表达进行相对定量,证明LINC00473促进了ATG7的表达。ATG7是miR-210-3p的靶点:通过Starbase分析了ATG7和miRNAs之间的关系（靶结合位点）,发现miR-210-3p可以靶向调节ATG7m RNA。通过构建miR-210-3p过表达细胞系,在两个细胞系中的实验结果均显示miR-210-3p过表达可降低ATG7的m RNA和蛋白表达,提示miR-210-3p可抑制ATG7的表达。构建双荧光素酶报告载体检测ATG7 m RNA和miR-210-3p之间的结合,通过比较两种细胞系中不同组的荧光素酶活性,证实Mi R-210-3p降低ATG7-WT组的荧光素酶活性。以上结果表明ATG7是miR-210-3p的靶点。LINC00473通过miR-210-3p/ATG7信号通路促进细胞自噬:构建的LINC00473过表达细胞系,根据网站预测的结合位点（WT和Mut）进行荧光素酶活性测定。在U251细胞中,与Mut组相比,Mi R-210-3p使LINC00473 WT组中的荧光素酶活性降低（P<0.01）,在U87中同样证实了类似结果（P<0.05）。最后,用western blot检测不同组的蛋白表达。LINC00473增强了ATG7的表达,可被miR-210-3p模拟物阻断,荧光素酶活性分析显示LINC00473与miR-210-3p结合。结论:1、LINC00473通过ATG7促进胶质瘤细胞的自噬行为,进而影响胶质瘤的增生侵袭等生物学行为,两者间是一个正向调节的关系。2、LINC00473通过ATG7介导自噬,miR-210-3p是ATG7的靶点,在调节过程中,LINC00473与miR-210-3p起到协同调节的作用,且在调节过程中miR-210-3p扮演了负向调控的角色。