目的对辽宁PED新流行毒株发病特征、遗传变异及抗原差异性进行研究,以明确PEDV辽宁流行毒株的遗传变异和抗原变化情况,为建立相应的诊断方法、筛选和研制相应的疫苗奠定基础,对疫苗特异性的提高和有针对性控制措施的制定提供了依据。方法在辽宁省的大连市、营口市、锦州市、葫芦岛市等几个地区,收集了3~20日龄哺乳仔猪出现腹泻的病例,应用病理学、病原学和PCR诊断方法进行诊断,针对确诊为PED并排除其他疾病的病例,首先观察并记录了剖检变化,然后采集发病猪的胃肠道、淋巴结、心、肝、肾等器官制作了组织切片,对组织切片进行病理组织学和免疫组织化学特征观察,总结了猪流行性腹泻病的发病特征。采集PED确诊阳性的肠道病料,应用Vero细胞进行病毒分离培养,通过电镜观察和基因序列分析方法进行病毒鉴定。对分离到的辽宁PEDVLN-2015-1新毒株S基因进行克隆和测序,应用分析软件对所得S基因核苷酸和氨基酸序列与传统毒株CV777和已经上市的PEDV变异疫苗株AJ1102及国内外PEDV序列进行同源性和变异分析,再与传统毒株CV777进行抗原表位比较,分析PEDVLN-2015-1新毒株是否发生了遗传变异和抗原变化。为了进一步确证新毒株S蛋白序列的变异是否导致其抗原性发生变化,应用大肠杆菌原核表达系统构建PEDV新毒株和传统毒株S基因表达蛋白,制备抗S蛋白多克隆抗体,通过间接ELISA试验、Western blot、交叉中和试验,对新毒株S蛋白与传统CV777毒株S蛋白进行抗原差异性比较分析。结果发病特征观察结果表明,辽宁省仔猪流行性腹泻主要集中于3~20日龄,病程一周左右,发病率和死亡率可达90%以上。主要特征性剖检病变表现在:小肠肠管扩张充气,肠壁变薄且透明,乳白色凝乳块在胃内蓄积,胃底粘膜潮红充血并附有粘液,肠系膜充血,肠系膜淋巴结等淋巴结充血肿胀,其他实质器官变性。主要特征性组织病理变化表现在:小肠绒毛上皮萎缩、坏死、脱落,黏膜固有层充血,淋巴细胞增多,腺体结构紊乱且腺上皮不完整。其他器官有变质和渗出性变化。免疫组化试验显示新分离PEDV蛋白在整个小肠和盲肠段均有表达,其中在十二指肠的小肠绒毛上皮细胞和小肠腺中呈强烈表达。病理学变化和免疫组化的检测结果表明辽宁新毒株比传统毒株侵害的器官更广泛,与临床上所表现的高发病死亡率相符合。说明该地区的PEDV流行毒株具有更高的致病性,免疫过传统疫苗的猪群仍然发病说明其抗原性可能发生了改变,需要进一步研究确证。应用Vero细胞进行病毒的分离培养,在辽宁成功分离到一株猪流行性腹泻病毒新流行毒株,命名为PEDVLN-2015-1,对其测序获得的全长4158bpS基因进行遗传变异和抗原表位分析结果表明,与传统毒株CV777基因对比,突变主要集中在S1区,存在插入、缺失以及点突变,S2区只有点突变。基因在173位、186位、437位分别存在3bp、9bp、3bp的插入,489位存在6bp的缺失,212位-224位出现13bp连续突变。氨基酸在59位和140位存在3aa和1aa的插入,163位存在2aa的缺失,同时在55位、68位、159位和199位存在连续3个及以上的氨基酸突变。同源性分析显示,PEDVLN-2015-1新毒株与2010年以前分离的传统毒株同源性较低,在93.2%-95.6%之间,与近年来国内外的变异毒株同源性较高,与HB-HA2015毒株的同源关系最近,序列相似性为99.2%,和国内上市的变异株AJ1102同源性97.6%,进化树分析显示该毒株与近年来国内外流行的变异毒株属于同一群G2亚群,与HB-HA2015形成一小的分支,与传统毒株进化距离较远。抗原表位分析结果表明,新分离毒株的S基因在5个表位区共发生16个氨基酸的突变。抗原差异性比较试验分析表明,PEDV LN-2015-1毒株S蛋白与传统CV777间交叉反应效价低,说明二者之间虽能形成一定的交叉保护力,但存在明显的抗原性差异。结论(1)从辽宁省成功分离到一株PEDV新流行毒株,命名为PEDVLN-2015-1,其发病特征表现为哺乳仔猪高发病率和死亡率,侵害胃肠道、肠系膜淋巴结等多种器官,表明辽宁新毒株比传统毒株侵害的器官更广泛,致病性更强;(2)新毒株PEDVLN-2015-1与传统毒株CV777对比,S基因发生了明显变异,与2010年以前的传统毒株同源性较低,与近年来国内外变异毒株同源性较高,和国内上市的变异株AJ1102同源性较高但存在一定差异;(3)抗原表位分析显示新毒株PEDVLN-2015-1S基因与传统毒株CV777对比在5个表位区发生16个氨基酸的突变,抗原交叉反应试验进一步确证新毒株S蛋白与传统毒株CV777之间存在明显的抗原性差异。本研究确证了辽宁PEDV新分离毒株的致病性和抗原性均发生了较大变化,需要筛选或研制新毒株疫苗对本病进行防控。