1目的通过检测复发性流产患者及RSA小鼠模型外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例及IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23细胞因子的水平,分析Th1/Th2、Th17/Treg细胞在RSA发病机制中的意义;探讨补肾安胎冲剂对RSA小鼠免疫调控的作用机理,为补肾健脾中药临床干预复发性流产提供理论支持。2方法搜集2019年01月至2019年12月于安徽中医药大学第一附属医院妇科及生殖中心门诊及住院治疗的脾肾亏虚证复发性流产患者20例作为研究组;同一时期正常早期妊娠患者20例作为对照组。酶联免疫吸附(ELISA)法检测患者外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23因子的表达;流式细胞术检测患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例。实验采用CBA/J×DBA/2的Clark经典反复流产模型小鼠30只,随机分为复发性流产模型组、中药低剂量组、中药高剂量组,每组各10只;采用CBA/J×BALB/c妊娠小鼠10只作为正常妊娠组。从小鼠被检测出妊娠的第1天起,予以灌胃处理:正常妊娠与模型组给予蒸馏水灌胃;中药高、低剂量组,分别为23.4g/kg.d、11.7g/kg.d,蒸馏水稀释灌胃,连续给药15天。小鼠末次给药24h后,予以处死,取出子宫,剖视观察胚胎发育情况,计算流产率及胚胎丢失率;酶联免疫吸附法检测小鼠外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23因子的表达;流式细胞术检测小鼠外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例。3结果3.1临床研究结果3.1.1两组患者一般情况比较两组患者年龄、孕周相比差异无统计学意义(P>0.05)。3.1.2 IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α在两组患者外周血中的表达与对照组比较,研究组患者外周血IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。3.1.3 IL-4、IL-5、IL-10在两组患者外周血中的表达与对照组比较,研究组患者外周血IL-4水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);IL-5、IL-10水平显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。3.1.4 IL-6、IL-17、IL-23在两组患者外周血中的表达与对照组比较,IL-6水平在研究组患者外周血中明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);IL-17、IL-23水平显著升高,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。3.1.5 CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例在两组患者外周血中的表达与对照组比较,研究组患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2实验研究结果3.2.1各组小鼠流产率、胚胎丢失率情况与正常妊娠组比较,模型组小鼠流产率、胚胎丢失率显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药高剂量组小鼠流产率、胚胎丢失率显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01);中药低剂量组小鼠流产率、胚胎丢失率明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);与中药低剂量组相比,中药高剂量组小鼠流产率、胚胎丢失率显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。3.2.2 IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α在各组小鼠外周血中的表达与正常妊娠组比较,模型组小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药高剂量组小鼠外周血中IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药低剂量组小鼠外周血中TNF-α显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01),IL-2、IL-12水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),IFN-γ水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05);与中药低剂量组比较,中药高剂量组小鼠外周血中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平显著降低,差异具有显著统计学意义(P<0.01),IL-12水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2.3 IL-4、IL-5、IL-10在各组小鼠外周血中的表达与正常妊娠组比较,模型组小鼠外周血中IL-4、IL-5、IL-10水平显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药高剂量组小鼠外周血中IL-4、IL-5、IL-10水平显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药低剂量组小鼠外周血中IL-4水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),IL-5、IL-10水平升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与中药低剂量组比较,中药高剂量组小鼠外周血中IL-4、IL-5、IL-10水平显著升高,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。3.2.4 IL-6、IL-17、IL-23在各组小鼠外周血中的表达与正常妊娠组比较,模型组小鼠外周血中IL-6、IL-17、IL-23水平显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药高剂量组小鼠外周血中IL-6、IL-17、IL-23水平显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药低剂量组小鼠外周血中IL-6、IL-17水平显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01),IL-23水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与中药低剂量组相比,中药高剂量组小鼠外周血中IL-6、IL-17、IL-23水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2.5 CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例在各组小鼠外周血中的表达与正常妊娠组比较,模型组小鼠外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药高剂量组小鼠外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药低剂量组RSA小鼠外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与中药低剂量组比较,中药高剂量组小鼠外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4结论4.1 Th1细胞分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12细胞因子水平在RSA患者及小鼠外周血中显著升高;Th2细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-10细胞因子水平在RSA患者及小鼠外周血中显著降低;Th1/Th2失衡,Th1型细胞因子分泌增多,向Th1型偏移,提示Th1/Th2失衡与复发性流产密切相关。4.2 Th17细胞相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-23水平在RSA患者及小鼠外周血中显著升高,CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例则显著降低,说明RSA在发病过程中,具有促炎作用的Th17型细胞因子水平上升,同时具有免疫抑制作用的Treg细胞减少,Th17/Treg平衡向Th17细胞偏移,下调母体对胎儿的免疫抑制,引起免疫平衡失调,导致流产。4.3补肾安胎冲剂能显著降低复发性流产小鼠模型的胚胎丢失率及流产率。4.4补肾安胎冲剂可抑制RSA小鼠外周血中Th1型细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α及Th17相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-23分泌,上调RSA小鼠外周血中Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-10水平及CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+、CD4~+Foxp3~+细胞比例,高剂量疗效更佳。4.5补肾安胎冲剂对母胎免疫耐受调节的可能机制4.5.1补肾安胎冲剂可抑制复发性流产小鼠Th1型细胞因子分泌,促进Th2型细胞因子分泌,纠正Th1/Th2平衡偏移,降低母胎免疫排斥,维持妊娠,有效降低了复发性流产小鼠的流产率及胚胎丢失率。4.5.2补肾安胎冲剂可促进Treg细胞的分化,下调Th17相关细胞因子水平,从而逆转Th17/Treg失衡,诱导母胎免疫耐受,有效降低了复发性流产小鼠的流产率及胚胎丢失率,治疗RSA。