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皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)是我国重要的海水养殖经济贝类,主要分布于山东、辽宁、福建等地,因其肉质鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱。然而,近年来由于人工苗种的累代养殖、近亲繁殖和养殖海区环境的恶化等问题,皱纹盘鲍种质退化严重,有害基因彰显,养殖群体遗传多样性不断下降,子代出现了生长慢、抗逆性差、死亡率高等问题,迫切需要开发养殖新品种。皱纹盘鲍雌性个体的卵色十分丰富,研究发现其卵色可能与生长、抗逆等经济性状相关,这为皱纹盘鲍的选育提供了新的思路。本文的研究内容主要包括以下两个部分:利用RNA-seq技术对皱纹盘鲍绿卵和灰卵个体的性腺组织进行转录组测序,通过GO和KEGG富集分析后,筛选与卵色形成相关的差异基因和代谢通路;对卵色相关基因GLT1进行c DNA末端的快速扩增实验,得到基因全长序列后进行相关分析,然后采用荧光定量PCR方法对GLT1基因在皱纹盘鲍不同月份不同组织中的表达模式进行分析。研究结果一方面为深入了解皱纹盘鲍卵色的遗传机制提供理论基础,另一方面能够挖掘卵色相关基因,为探究卵色相关基因的功能及调控机理提供基础数据。主要研究结果如下:1两种卵色皱纹盘鲍性腺组织转录组分析本研究共构建了六个转录本文库,包括绿卵组个体三个(L1、L2、L3)和灰卵组个体三个(H1、H2、H3),获得了44.56 Gb的clean reads,拼接得到了461,162个转录本序列,经层次聚类后得到272,310个基因序列,这些基因序列的平均长度为985 bp,N50值为1,524 bp;与灰卵组个体相比,总共有185个显著差异基因(P<0.05)在绿卵组个体中被鉴定出,其中包括54个显著上调差异基因和131个显著下调差异基因;通过在GO和KEGG数据库进行功能注释,筛选出与卵色形成有关的多个terms和pathways,如“含黄素化合物的代谢过程(flavin-containing compound metabolic process)”、“酪氨酸代谢过程(tyrosine metabolic process)”、“黑色素浓缩激素活性(melanin-concentrating hormone activity)”、“黑素小体(melanosome)”、“色素颗粒(pigment granule)”、“细胞色素b6f复合物(cytochromeb6f complex)”、“色素代谢过程(pigment metabolic process)”、“谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)”等。随机选取了9个感兴趣的基因进行q RT-PCR分析,结果显示9个差异基因在q RT-PCR和RNA-seq数据中的表达趋势一致,说明了转录组数据的可靠性。2谷氨酸合酶基因(GLT1)的克隆及表达分析本研究克隆得到了一个皱纹盘鲍GLT1基因,其c DNA全长为7,640 bp,包括5’非编码区(UTR)381 bp,3’UTR 1,025 bp,开放阅读框(ORF)6,234 bp,含1个ATG启动子和1个TGA终止子,编码2,077个氨基酸,理论等电点为6.32,预测分子量为230.02 k Da,经SMART预测分析,编码氨基酸序列包括的结构域有:GATase＿2、Glu＿syn＿central、Glu＿synthase、GXGXG、Fer4＿20、NAD＿binding＿8。BLAST分析结果表明,皱纹盘鲍GLT1基因的氨基酸序列与虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)GLT1基因的同源相似性最高,为73%,与福寿螺(Pomacea canaliculata)的同源相似性为72%,与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的同源相似性均为71%。多序列比对发现,皱纹盘鲍GLT1基因与其他8个物种共10种GLT1基因的氨基酸序列在结构域位置的高度保守区域较多,其中结构域Glu＿synthase的高度保守区域最完整。系统进化分析显示皱纹盘鲍GLT1基因首先与福寿螺、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)、加州海兔(Aplysia californica)等腹足纲聚类,再与虾夷扇贝、美洲牡蛎、太平洋牡蛎等瓣鳃纲聚类。通过荧光定量PCR方法检测了GLT1基因在雌雄皱纹盘鲍不同月份不同组织中的表达分布情况,结果显示,无论雌雄个体,GLT1基因在肌肉、外套膜、性腺和鳃中均有表达,其中以肌肉组织中的表达量最高,但在肝胰腺组织中均未见表达;对于性腺组织来说,GLT1基因在这5个月里的表达情况都呈现出先上升后下降,然后逐渐稳定的趋势,其中6月的表达量显著高于其它月份(P<0.05)。