恶性肿瘤浸润和转移是肿瘤患者死亡的主要原因。恶性肿瘤无限制地侵袭生长及其转移依赖于血管生成和细胞外基质的降解。新生的血管不仅提供肿瘤所需的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的途径。肿瘤的侵袭及转移是一个复杂的过程：首先，肿瘤细胞与基底膜表面的整合素受体及非整合受体结合，其次，破坏由细胞间基质和基底膜（BM）组成的细胞外基质（ECM），最后，穿过细胞外基质缺损处进入局部淋巴系统及毛细血管，在远隔部位突破毛细管结构，形成新的转移灶。在这个复杂的过程中，有一个非常重要几乎贯穿始终的因素就是BM和ECM的降解。基质金属蛋白酶（MMPs）是降解BM、ECM最重要的蛋白水解酶类，而MMP―2又是基质金属蛋白酶家簇中尤为重要的一种。MMP-2以非活性的酶原形式分泌,它的激活需要MT-MMPS 、TIMPS 、αvβ3 的协助：TIMP2首先结合活化的MT1-MMP的N端,然后通过TIMP2的C端结合ProMMP2的C端区域,从而形成MT1MMP- TIMP2-ProMMP2复合物,接着在另外一游离分子TM1-MMP的作用下ProMMP2裂解成有活性的MMP2；ProMMP2也可以通过C端区域直接与αvβ3作用，使之成为有活性MMP-2。活化的MMP2与整合素αvβ3再进一步结合，降解ECM，促进血管生成和肿瘤侵袭及转移。最近Brooks等发现MMP-2可通过C端与整合素蛋白家族成员αvβ3结合，激活自身催化活性，产生C端类血红素结合片断PEX（Hemopexin）,该片断可阻断MMP-2与αvβ3结合而抑制MMP-2对ECM降解和血管的形成，提示PEX片断有可能成为抗肿瘤血管生成新的生物活性药物。PEX是MMP-2的羧基末端降解产物，无信号肽序列，为了研究其基因在真核细胞中表达的抗血管生成作用，需要在PEX基因前加一分泌信号肽，从而介导分泌蛋白到达细胞外，且不影响分泌蛋白的活性。<WP=95>MMP-2的氨基端本身存在87bp的信号肽序列（Sig），而且此分泌信号肽有着较高水平表达，因此本实验采用与蛋白同源的分泌信号。本研究利用分子生物学技术，克隆分泌型Sig-PEX cDNA基础上，构建了pcDNA3.1- Sig-PEX 的真核表达载体，并将其转染入鼠黑色素瘤细胞系B16F10中，通过体外、体内实验研究PEX对肿瘤细胞侵袭和转移的抑制作用，并对其作用机制进行了初步探讨。结果如下：1. pcDNA3.1-Sig-PEX 真核表达载体的构建及鉴定根据Gene Bank设计并合成两对引物，在Sig-F 5’端设计了NheI 酶切位点，在 PEX-R 3’端设计了XhoI酶切位点，从NIH3T3 细胞中提取总mRNA ,采用RT-PCR的方法，分别以 Sig-F/Sig-R和PEX-F /PEX-R二对引物扩增Sig和PEX片段，再以两片段混合物为模板， Sig-F / PEX-R为引物，利用复合式PCR方法扩增 Sig-PEX cDNA片断。将获得的目的基因克隆入pMD18-T 质粒，将重组质粒的插入片断经DNA自动测序仪进行序列分析，结果表明，我们所获得的外源基因与已发表的序列完全相同。用NheI、XhoI 双酶切 pMD18T- Sig-PEX ，将切下片段回收纯化，纯化片断定向次级克隆入经相同双酶切的pcDNA3.1真核表达载体中，经酶切鉴定证明重组质粒构建正确，命名为pcDNA3.1- Sig-PEX质粒。2. 重组质粒的表达采用脂质体介导转染法进行真核细胞转染，将pcDNA3.1- Sig-PEX真核表达载体转染入鼠黑色素瘤细胞系B16F10中，利用G418筛选，筛选出抗G418的单克隆细胞，分别为：转Sig-PEX基因的B16F10细胞株（BpcDNA-sPEX）、转空载体的B16F10细胞株（BpcDNA）。用RT-PCR方法检测到BpcDNA- sPEX中有Sig-PEX mRNA 的表达。经Western blot分析显示，在带有目的基因的细胞上清中见有22KD的额外蛋白带，证明转染入细胞的目的基因成功获得表达，并且信号肽能引导目的基因到达细胞外。3. PEX基因对黑色素瘤细胞生物学性状影响的体外研究3.1 PEX基因对B16F10细胞增殖的影响绘制了BpcDNA-sPEX、BpcDNA和B16F10细胞的生长曲线，结果显示，转基因组、空载体组及对照组相比，细胞增殖无明显差别，说明<WP=96>PEX基因转染对体外B16F10细胞增殖无影响。3.2 PEX基因对B16F10细胞周期的影响经流式细胞仪分析，转基因组与空载体组、对照组相比，细胞周期各时相无明显变化，说明PEX基因转染细胞后对其细胞周期无影响。3.3 PEX基因对B16细胞超微结构的影响普通倒置显微镜下，BpcDNA- sPEX、BpcDNA细胞与亲代B16F10细胞相比，细胞形态、状态没有明显差异。透射电镜观察 BpcDNA-sPEX、BpcDNA及B16F10细胞株均表现为细胞多核、核大、胞浆较少和线粒体增多等恶性肿瘤细胞特点，细胞表面有微绒毛，内质网丰富，不同组别细胞未见明显差别。3.4 PEX基因对黑色素瘤细胞侵袭能力的影响我们做了软琼脂克隆实验，将BpcDNA-sPEX、BpcDNA及B16F10细胞培养于立体琼脂内，培养2周后，细胞呈现出克隆性生长，结果表明，BpcDNA-sPEX组细胞集落与BpcDNA组和B16F10组相比统计学上存在显著性差异（p﹤0.01），BpcDNA-sPEX组细胞集落比BpcDNA组和B16F10组少，且单个集落中细胞数目少，说明PEX基因可抑制B16F10细胞在软琼脂中形成集落的能力，降低了肿瘤细胞的恶性表型。Boyden小室侵袭能力测定，BpcDNA-sPEX组与BpcDNA和B16F10组相比，BpcDNA-sPEX组细胞穿透Matrigel胶能力比BpcDNA和B16F10组细胞弱，统计学上存