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背景 肿瘤家族中，癌遗传易感因素比其它致癌因素起的作用更明确。检测生殖系细胞的基因突变来鉴别癌遗传易感性，已经成为生命科学领域研究的焦点之一。遗传性非息肉病性结、直肠癌（HNPCC）通常与至少3个目前已知的DNA错配修复基因相关，它们是hMSH2，hMLH1和hMSH6基因。大部分的HNPCC家族有hMSH2和hMLH1的突变。在这2个基因引起结、直肠癌遗传发病的风险增加的同时，通常伴随着在肿瘤标本中微卫星体的不稳定（microsatellite instability，MSI）。hMLH3是2000年克隆和定性的错配修复基因。定位于14q24.3，编码区全长4.3kb，由12个外显子组成，其中第一外显子3.3kb，占全部的75％。研究表明它的突变在家族性大肠癌的发生中可能起一定的作用，迄今未见该基因在其它肿瘤中的突变报导。中国为世界上食管癌的高发区，食管癌占各部位恶性肿瘤导致死亡原因的第二位，严重威胁着人们的健康。 目的 探讨hMLH3基因在结直肠癌和食管癌中的作用，即hMLH3基因在家族性结直肠癌和家族性食管癌中的突变情况。 方法 （一）关于结直肠癌家族 采用聚合酶链反应（PCR）、变性高效液相色谱分析（DHPLC）和直接测序法，筛查有遗传素质的70个结直肠癌家族的索引病人中hMLH3基因的生殖系突变（germline mutation）情况。 PCR将hMLH3基因第1外显子划分为7个重叠的片段，而将片段过短、且相距很近的外显子9和10划为一个片段，因此共设计17对引物。将其分别予以扩增，反应体系为50μl，含有100ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，1.5mM的Mg2+，100μM的各种dNTP，0.2μM的各种引物，和1.25单位的 Ampli TaqGOLD聚合酶。 o一主要原理为：将退火处理后的PCn样品置于TranseenondcWave DNA片段分析仪中。自动采取 10pl样品注人 DNA层析柱，PCR产物在流动相以0．gndndn的速度带至DNA层析柱，在一定温度和乙睛的线性梯度下，具有不同特性的 DNA双链得以分离，并可被紫外线吸收仪在波长为254urn处检测到，表现为特征性的洗脱峰＊lution Peak人纯合的野生型 DNA表现为单一窄峰，而突变型和野生型 DNA组成的杂合于样品则表现为提前出现的一个或多个的额外洗脱峰，从而得以鉴别。整个方法的核心是层析柱所处的温度（异源杂合双链和纯合双链得以分离的温度）和流动相缓冲液的梯度，主要是利用 WAVEMAKERW 3．4软件，根据比R产物的大小和组成特点，来计算和调整。 测序（1）重新进行 PCR扩增；（2）用 QIAquick PCR Plcation Kit（PCR纯化试剂盒）进行纯化；切直接测序，采用 BigDye Terminator V3·0 ReadyRe眈nonCyCIeSegu。Cing Kit进行双向测序反应。M反应产物经酒精沉淀后在ABI PRISM 377DNA测序仪上电泳，以测出碱基序列。 对有基因突变的索引病人所在的结直肠癌家族，针对每一名成员（包括发病和未发病者厂检测血液和肿瘤标本DNA中hMLH3的致病性突变，进行家系分离（segregatio）研究，并与散发性结直肠癌病例和正常对照相比较，建立基因型（基因突变）和表现型（结直肠癌）间的某种联系。 闰对于食管癌家系选择标准：＊）至少两代；②至少两个食管癌患者；③一级亲属；M发病年龄较年轻（＜so岁人对收集的ic个食管癌家族K个来自国内，6个来自瑞典）共66名成员，针对每一名成员（包括发病和未发病者入检测血液和肿瘤标本DNA中hMLH3的致病性突变，进行家系分离研究，并与散发性食管癌病例和正常对照相比较，建立基因型（基因突变）和表现型（食管癌）间的某种联系。采用的实验手段主要为聚合酶链反应瞩CR厂变性高效液相色谱分析（DHPLC）和直接测序法。 结 果 在全部样品中所有的hMLH3基因的外显子均得以成功进行PCR扩增山HPLC分析和基因测序。 ·二· H在结直肠癌家系 在16个索引病人p3％）中发现了 1处移码突变（frameshif mutation）和10处错义突变(dssense mutation人在家系 141中发现的移码突变885delG，是最有可能有致病性的突变，因为它随即导致了编码蛋白的截短。在家系199中发现，hML鹏基因的错义突变与另一个错配修复基因hMSHZ的错义突变在一起与肿瘤的发生有关。并且，有hMLH3基因突变的肿瘤均为MSI阴性。发现突变的家系可分为两种类型：高危家系（包括HNPCC家系，遗传性结直肠癌家系（HCRC）和子宫内膜癌家系）和低危家系(包括两名一级亲属患结直肠癌的TCR家系和仅有一例早期患病亲属的OCR家系人70个家系中有42个高危家系和28个低危家系组成。突变发现于14％的高危家系和36％的低危家系。总之，通过对所有结直肠癌家系的研究，结果表明在家系141j4和199中人MLH3基因的突变具有致病性的和较高的外显率。因为这些突变与疾病相关，仅见于这3个家系，而在散发性结直肠癌患者和正常对照中没有此项突变。然而在大多数家族中的研究结果表明hMLH3可能不是结直肠癌家族的单一高风险基因，大多数的突变发生于低风险的人群中。在基因突变和结