丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草属草本植物,以根和根茎入药,是我国重要的中药材之一,有悠久的临床应用历史,具有保护心血管、抗血栓形成、促进组织的修复和再生等作用。现有研究表明,丹参的两大活性成分为脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物,其中水溶性酚酸类化合物是丹参的主要药用成分之一,获得普遍关注。已有研究表明,丹参酚酸类化合物的合成经过苯丙烷和酪氨酸两条代谢途径共同参与完成,产生的迷迭香酸是丹酚酸B的核心前体。目前对丹参功能基因的研究已全面展开,酚酸合成途径及其代谢支路途径的关键酶基因均已克隆,而这些酶基因广泛受转录因子的调控。目前发现,在丹参内过表达外源MYB转录因子基因(拟南芥PAP1,PAP2),引起酚酸类合成途径的酶基因以及相关代谢产物的变化,而丹参内源MYB转录因子是否具有类似调控酚酸类化合物合成的机制,这尚不明确,值得研究。SmPAP1基因(GenBank:GU218694.2)是丹参R2R3MYB类转录因子之一,与拟南芥AtPAP1存在高度相似性。为探究SmPAP1基因是否参与调控丹参酚酸类合成途径,本文在已有研究基础上,构建人工miRNA(amiRNA)载体,旨在对SmPAP1基因进行特异性沉默,探讨该转录因子的下调对丹参酚酸类成分合成途径中相关酶基因及代谢产物的影响,明确转录因子SmPAP1丹参酚酸类合成中的潜在调控作用。本研究旨在探讨丹参水溶性酚酸类化合物积累的作用机制及其调控模式,为丹参分子育种和品质提高奠定基础,为丹参进行品系改良提供新的思路及策略。主要的研究内容及结果如下：1.选择SmPAP1非保守区为模板,利用WMD(Web microRNA designer)平台设计针对SmPAP1的amiRNAs序列,利用重叠PCR(overlapping PCR)技术置换拟南芥MIR319a前体序列,构建特异性沉默SmPAP1的人工miRNA载体。2.以丹参根、茎和叶的cDNA为模板,利用实时荧光定量PCR技术对SmPAP1基因的表达模式进行了研究发现,SmPAP1基因在丹参的根、茎和叶中均有表达,但在叶中的丰度最高,茎次之,根中含量较低。3.利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法转染丹参叶片,经DNA和RNA水平的检测后,共获得转amiRNA-SmPAP1丹参阳性株系8个,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对转基因植株检测：转基因株系中SmPAP1均显著低于野生对照,沉默效率从30%-97%不等。对amiRNA检测结果显示,转基因株系中amiRNA表达均高于对照株系,说明构建的amiRNA前体在丹参中成功表达,实现对靶基因的切割,达到了基因沉默的效果。其次,SmPAP1基因在转基因株系的根、茎、叶中都有表达,叶片中表达量最高,根茎较低,同样存在组织表达差异性,且表达丰度均低于在野生丹参各组织中表达丰度。4.分析45d龄组织培养试管苗干涉及对照株系中总酚酸、总黄酮及花青素含量,结果显示三种成分均有降低：转基因株系4##的总酚酸、总黄酮及花青素含量分别是对照的61.56%、64.05%和49.47%；9##株系的总酚酸、总黄酮及花青素含量分别是对照的48.42%、56.88%和36.81%；24##株系的总酚酸、总黄酮及花青素含量分别是对照的73.68%、77.57%和38.35%。5.采用HPLC技术检测丹参45d龄实生苗及对照株系的丹酚酸B的变化,结果显示：转基因株系较对照株系丹酚酸B含量明显降低,4##和9#株系中含量仅为对照的44.94%和50.72%。6.为了进一步探究SmPAP1基因的表达变化对丹参酚酸类化合物合成途径影响的分子机制,对转基因株系及对照株系酚酸类活性成分次生代谢途径中的10个关键酶基因的表达丰度进行分析。结果显示：苯丙烷中心代谢途径中的PAL、C4H、4CL1、RAS基因以及酩氨酸代谢途径中的TAT和HPPR基因在在干涉株系中的表达量较对照显著降低。类黄酮代谢途径中CHS、FLS基因以及木质素代谢途径的HCT、COMT基因同样有不同程度下调。7.丹参SmPAP1基因沉默株系的表型观察结果显示,45d龄实生苗的根和对照株系存在明显差异：由于酚酸合成途径及其木质素、类黄酮等分支途径中关键酶基因均有不同程度下调,因此出现木质素积累不足,酚酸以及总黄酮等含量较低等现象,导致转基因株系形态发生变化：地下主根单一且较短,多数为须根,主根表面浅红色,质地较脆,植株茎秆纤细柔弱,易于折断。结论：本研究通过构建artificial miRNA载体介导SmPAP1基因特异性沉默,获得转基因株系,初步探讨SmPAP1转录因子对丹参酚酸类活性成分合成的影响。实验证明了该转录因子通过调控代谢途径关键酶的表达,进而影响次生代谢产物的积累,说明SmPAP1转录因子在丹参酚酸类物质的合成及表达中具有重要的调控作用。这为提高药用植物中次生代谢产物的积累提供新的思路。