真姬菇是一种来自北温带的大型食用真菌,属于珍稀食用菌种。自上世纪八十年代自日本引入我国以来,历经数十年的产业培养,已成为我国食用真菌产业中不可或缺的一环。当前,真姬菇遗传转化系统的构建已经初步建立,但转化系统尚存在一定缺陷,使用的受体主要为原生质体,原生质体制备过程繁琐,需要使用溶壁酶消化菌丝体细胞壁,制备成功的原生质体需要保存在高渗溶液中以保持稳定的渗透压,由于原生质体非常脆弱,在离心收集原生质体时很容易因为过高的离心力而破裂。另外,部分原生质体在制备过程中有一定概率丢失细胞核,使得建立的转化体系效率过低,因此原生质体不是进行转化的理想材料,真姬菇节孢子因其制备方法简单,细胞不似原生质体般脆弱,且计数简单,可以更直观地表现转化效率且再生率较高,优于以原生质体作为受体的转化体系,因此本实验使用农杆菌介导转化法,以真姬菇节孢子作为受体进行转化,拟构建出一套成功的真姬菇遗传转化系统。本文的研究结果如下:1.对真姬菇单核菌丝产生节孢子数量的相关因素进行了研究,包括平板培养时间、菌株类型等。通过对比,最终确定不同的菌株类型产生的节孢子数量略有差异,但通过十天以上的培养通常可以获得106-108/ml数量级的节孢子。实验确定的最佳单核菌丝培养时间为20天。2.通过实验确定了农杆菌EHA105转化真姬菇节孢子的平板筛选条件,条件如下:萎锈灵2mg/L,头孢噻肟霉素300mg/L。3.实验以PCAMBIA2301为骨架,酶切切去卡那霉素抗性筛选基因并连接全新的β-胡萝卜素合成基因crt IBY,构建出全新的中间载体p001,进行酶切连接经过PCR扩增的来自杏鲍菇的完整萎锈灵抗性筛选基因获得重组质粒p Sdi-crt IBY,成功构建了携带Sdi筛选标记与GUS基因的转化质粒。4.将构建成功的重组质粒p Sdi-crt IBY转入到农杆菌菌株EHA105中,以真姬菇F4,F2,B5-15单核菌丝产生的节孢子作为受体材料,使用根癌农杆菌介导的转化方法进行实验。经过萎锈灵抗性筛选,PCR鉴定及GUS染色实验验证,证明了转化质粒上的外源基因成功转入真姬菇基因组中,实验成功得到了获得稳定遗传性状的转化子,构建了以真姬菇节孢子作为受体的农杆菌介导转化体系且转化效率相对目前所报道受体为原生质体的体系更高。5.实验选择了部分可能影响转化效率的条件并对这部分条件加以优化,条件分别为农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间及酚类物质作用。针对以上四个因素进行相关实验,最终优化结果为:最佳预培养农杆菌菌液浓度为OD6000.5,最佳节孢子侵染时间20min,最佳共培养时间48h,需要添加乙酰丁香酮。6.对转化子生长速度,菌丝表型加以测定并完成出菇实验。结果显示部分转化子生长速度与野生型菌丝相比出现变化,个别转化子菌落形态略有改变,这可能是由于在农杆菌转化过程中T-DNA的随机插入影响了DNA中与菌落形态的相关基因。同时菌丝颜色发生改变,接种块附近呈现淡黄色并逐渐向四周扩散,颜色随菌丝生长逐渐淡化。绝大多数转化子经过杂交配对后,在适宜的条件下可以正常出菇,子实体形态观察结果表明转化子形态较野生型未有较大区别。