论文部分内容阅读
目的:研究低频脉冲电磁场(PEMF)对去卵巢大鼠核因子κB受体活化因子(RANK)、活化T细胞核因子(NFATc1/NFAT2)、碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)、空泡型H+三磷酸腺苷转运酶(Ⅴ-ATPase)基因表达的影响;研究NFAT2对CAⅡ和Ⅴ-ATPase基因表达的调控作用。 方法:1.选取48只雌性SD大鼠，分为三组，分别为SHAM（假手术）组、OVX（去卵巢）组、OVX+PEMF组，OVX+PEMF组随机选一半被PEMF干预14天和28天，测雌激素和骨密度。RT-PCR检测NFAT2、RANK、CAⅡ和Ⅴ-ATPase基因的表达。 2.设计NFAT2-RNAi siRNA干扰序列，合成shRNA Oligo片段，将目的基因连接于干扰慢病毒骨架载体上。转化至感受态细胞STBL3，抽提阳性菌落并测序验证。将重组慢病毒载体和包装质粒共转染至293T细胞，收集浓缩病毒上清液，利用荧光法测定病毒滴度。选择干扰效率最高的慢病毒进行后续实验。 3.采用4周龄SD大鼠提取骨髓基质干细胞(BMSC)，诱导成破骨样细胞(OLC)，加入不同干预，分为三组，分别为OLC对照组、VIVIT(NFAT2抑制剂)组、NFAT2iRNA慢病毒组，RT-PCR检测NFAT2、CAⅡ和Ⅴ-ATPase基因的表达。 结果:1.OVX组BMD和E2显著低于SHAM组（P＜0.001），PEMF干预28天后，OVX+PEMF组BMD明显高于OVX组（P＜0.01）;OVX+PEMF组中RANK和Ⅴ-ATPase的表达均低于相应OVX组;PEMF干预28天后，与OVX组对比，OVX+PEMF组CAⅡ和NFAT2基因表达显著降低（P＜0.01)。 2.重组干扰慢病毒载体pL/shRNA/GFP-NFAT2序列经鉴定，测序结果与Genebank中的基因序列比对显示一致;干扰效率最高的慢病毒滴度为4×108TU/ml。 3.经过不同干预后，VIVIT组和NFAT2iRNA慢病毒组的NFAT2、CAⅡ、Ⅴ-APase的基因表达明显低于OLC组(P＜0.05)。 结论:PEMF可调节RANK、NFAT2、CAⅡ和Ⅴ-ATPase基因的表达;Ca2+/Calcineurin/NFATc1信号通路可能直接调控CAⅡ和Ⅴ-ATPase的表达。