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第一部分:新生小鼠脊髓神经干细胞分离、培养及鉴定目的:分离培养新生小鼠脊髓神经干细胞,并进行增殖、分化的鉴定,为进一步研究脊髓神经干细胞的生物学特性奠定基础。方法:取6只新生小鼠,无菌预冷条件下取脊髓组织,采用机械分离吹打成单个细胞后,利用无血清进行原代细胞培养,采用机械法联合胰酶消化法对原代细胞进行培养和传代。应用免疫荧光法行巢蛋白,CD133染色,微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对脊髓神经干细胞及分化产物进行鉴定。结果:从小鼠脊髓中分离的神经干细胞具有克隆的能力,克隆细胞呈巢蛋白、CD133免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-tubulinⅢ和GFAP阳性细胞。结论:机械法分离新生小鼠脊髓细胞。使用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代和培养,能够成功获得脊髓神经干细胞,能够诱导其分化为神经元和星型胶质细胞。第二部分:叶酸联合脊髓神经干细胞治疗小鼠局灶性脑梗目的:研究叶酸联合脊髓神经干细胞对缺血性脑卒中小鼠的治疗作用,探讨其可能的机制。方法:60只昆明雄鼠随机分为3组,脑梗组(A组),脑梗+神经干细胞移植组(B组),脑梗+神经干细胞+叶酸注射组(C组)。在脑梗前28d和脑梗后23天C组给予叶酸悬液。每周测量各组血清叶酸浓度。用光栓法建立脑缺血小鼠动物模型。在脑梗后第2天移植BrdU标记的神经干细胞。在小鼠脑梗后第21天,随机从各组取5只小鼠,切片后行尼氏染色和Fluo-Jade染色,同时计数神经元。用免疫双标法检测双阳性细胞数;用疫印迹法检测脑组织中凋亡基因Bax、Caspsse-3的表达。结果:与A组和B组相比,C组血清叶酸浓度明显增高。与A组相比,C组顶叶皮质神经元数增多(P<0.05);与A组和B组相比,C组免疫荧光双标阳性细胞数高(P<0.05);与A组相比,C组凋亡蛋白Bax、Caspsse-3含量下降(P<0.05)。结论:通过补充叶酸,能提高小鼠血清血清叶酸浓度,促进移植神经干细胞存活和分化,同时减轻中枢神经中细胞的凋亡,从而达到治疗作用。