目的:为研究红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP/Ds-Red)基因在活细胞中作为报告基因的可能性,特建立重组慢病毒(Lentivirus)三质粒载体系统,以转染的方式,将其导入人膀胱移行细胞癌细胞(T-24),在倒置/激光共聚焦荧光显微镜下观察癌细胞表达红色荧光蛋白的情况。方法:将重组LV-RFP慢病毒载体(LV-CMV-RFP)及两种包装载体pHelper 1.0载体和pHelper 2.0通过脂质体(Lipofectamine 2000)共转染293T细胞(严格按照试剂盒说明操作),经3-4天共孵育后,并收获浓缩病毒。将病毒浓缩液移出,分装后保存在病毒管中,-80℃长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。以孔稀释法或Real Time定量PCR法测定病毒滴度。将测定好的重组慢病毒颗粒以不同的MOI值分三组与接种于96孔板的T-24细胞共同孵育72-96小时,摸索最佳感染条件。以预试验确定的结果重复感染T-24细胞。以558nm为激发波长,583nm为接收波长,在荧光显微镜下观察细胞表达RFP情况。经流式细胞仪检测确定感染效率。将已转染的细胞与未转染的细胞共同培养,观察细胞生长特性。结果:成功构建了Ds-Red重组慢病毒三质粒载体,并顺利转染至人膀胱癌T-24细胞,在倒置/激光共聚焦荧光显微镜下已转染的T24细胞发出强烈的红色荧光。结论:Ds-Red基因能以慢病毒三质粒载体的形式在人膀胱移行细胞癌细胞(T-24)细胞中成功表达,并发出红色荧光,而且可以直接利用荧光显微镜对活细胞进行检测,因此Ds-Red基因是一种良好的活细胞报告基因和筛选标记。