精子的运动是评价精液质量最关键的指标之一,而精液质量又是影响鱼类受精率的主要因素。所以如何提高精子运动,精子质量以及卵子受精率已经是鱼类生产繁殖过程中的重要问题。有研究报道,细胞自噬相关蛋白参与了人的精子运动过程,本文则利用了细胞自噬抑制剂氯喹来研究在鱼类中,细胞自噬过程是否参与了精子的运动以及如何调节精子的运动,首先我们利用腹腔注射的方法处理黄颡鱼雄鱼,发现氯喹可以显著提高黄颡鱼精子的运动活力,对平均路径速度(VAP)、直线运动速度(VSL)和曲线运动速度(VCL)几个运动参数进行了显著提高。结果显示,100μM浓度的氯喹对黄颡鱼精子运动速度的提高效果最好。而1000μM浓度的氯喹则会抑制黄颡鱼精子的运动。随后,我们利用人工繁殖黄颡鱼的方法,检测了100μM浓度氯喹对精子活力、卵子受精率以及孵化率的影响。发现,相同条件下,氯喹处理组可以显著提高黄颡鱼受精率,而且并不会影响胚胎的孵化率。同时,我们还对其分子机制进行了初步的探索,发现氯喹在提高精子运动的同时,也影响了黄颡鱼精巢中的细胞自噬过程。本研究还利用了转录组测序的方法对正常黄颡鱼精巢和氯喹处理后黄颡鱼精巢进行了高通量测序。测序结果发现,在处理组中有4686个Unigenes发生了变化,其中2144个Unigenes发生了上调,2542个Unigenes发生了下调。有趣的是,GO富集分析显示,下调的Unigenes中,许多被分配到了toll-like受体信号通路中。KEGG富集分析发现,PI3K/AKT信号通路则发生了上调。所以,氯喹很可能是通过影响细胞自噬过程,PI3K/AKT信号通路和toll-like受体信号通路,进而影响了黄颡鱼精子的运动。因为黄颡鱼的遗传信息和分子基础很薄弱,我们很难在黄颡鱼中开展更加深入的研究,所以我们利用更加容易操作且遗传信息已经十分清晰的模式生物斑马鱼为研究对象,探究细胞自噬过程和PI3K/AKT信号通路对精子运动的影响。由于氯喹并不是一种水产养殖过程中的常用药物,所以我们希望可以筛选一种与氯喹功能类似的安全的小分子化合物,来应用到养殖过程中。以前的研究发现,多种氨基酸会参与到细胞自噬过程中,我们利用腹腔注射和计算机辅助分析精子活力的方法发现,亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸可以显著促进斑马鱼的精子运动,而缬氨酸和半胱氨酸会抑制斑马鱼精子运动,其他的氨基酸对精子运动没有显著影响。随后,我们以促进效果最好的亮氨酸为研究对象,实验结果显示,亮氨酸会抑制自噬体和溶酶体的融合,进而抑制细胞自噬。这说明,亮氨酸可以通过抑制细胞自噬后期过程,进而促进斑马鱼的精子活力,而且其在精子运动中的功能与氯喹功能很相似。我们进一步利用PI3K/AKT信号通路的抑制剂和激活剂分析PI3K/AKT信号通路是否参与精子运动过程。实验结果发现,当我们用化合物LY294002处理斑马鱼精巢时,PI3K/AKT信号通路和细胞自噬的发生受到了抑制,精子活力发生下调,当用IGF-1处理斑马鱼精巢时,PI3K/AKT信号通路受到激活,精子活力发生上调,当我们用亮氨酸处理斑马鱼精巢时,PI3K/AKT信号通路受到激活,精子活力发生上调,说明PI3K/AKT信号通路确实参与了精子的运动过程。总的来说,当细胞自噬前期自噬体的形成受到抑制时,精子的运动会降低,当亮氨酸和氯喹抑制细胞自噬后期,自噬体和溶酶体的融合时,会促进斑马鱼和黄颡鱼的精子活力,这可能是因为LC3蛋白水平较高,可以保障精子的活性。在这一过程中,PI3K/AKT信号通路起着重要的作用。而且,亮氨酸作为常见的营养小分子,可以作为一种方便的药物添加剂,应用于黄颡鱼等鱼类的人工繁殖中。