Decoy ODN靶向抑制人谷胱甘肽S-转移酶P1基因表达对肺癌细胞铂类耐药的影响

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肺癌发病率在所有肿瘤中居前列,其发病率居高不下且有逐年上升的趋势。进展期肺癌患者大多只能依靠化疗取得较好的预后效果,但肺癌化疗效果的个体差异很大。因此,寻找一种能够指导肿瘤病人化疗方案制定的分子标志物,对于肿瘤病人的个体化治疗具有重要价值。有文献报道,GSTP1可能与癌细胞对化疗药的耐受性相关,是癌细胞抗药性的标志之一,可作为临床上预测GSTP1在肿瘤组织或器官中表达与化疗耐药性相关的指标。基于此,本实验以GSTP1基因作为铂类耐药研究的靶点,运用decoy ODN技术靶向抑制GSTP1基因表达,研究其对人肺癌细胞在化疗药物卡铂(Carboplatin,CBP)的影响下增殖和凋亡情况的改变。方法:MTT法测定卡铂作用下A549细胞的生长抑制率及IC50;设计并合成三条寡核苷酸序列:①针对GSTP1基因上的转录因子结合位点(transcriptionfactor binding site,TFBS)合成的ApSpBS;②针对GSTP1基因上的RNA聚合酶结合位点(TATA box)合成的RNApolBS;③在ApSpBS基础上乱序合成的Scrambled ODN序列;转染并摸索最适转染浓度;Western blot测定转染后不同组GSTP1蛋白表达差异;免疫细胞荧光染色观察转染并加药后不同组GSTP1表达的差异;MTT检测转染并加药后不同组之间A549细胞生长抑制率的差异;流式细胞术测定转染并加药后不同组之间细胞凋亡及坏死率的差异。结果:MTT法测定卡铂作用下A549细胞的IC50为91μg/mL。转染最适浓度为100nM;Western blot测定转染后ApSpBS组、RNApolBS组与Scrambled ODN组相比GSTP1表达明显降低(p<0.01);ApSpBS组、RNApolBS组与对照组相比GSTP1表达明显降低(p<0.01);而Scrambled ODN与对照组相比无显著差异(p>0.05)。免疫细胞荧光染色结果显示ApSpBS组、RNApolBS组GSTP1阳性表达明显弱于Scrambled ODN和对照组。 MTT结果显示ApSpBS-CBP组、RNApolBS-CBP组A549生长抑制率明显高于Scrambled ODN-CBP和CBP组,有极显著性差异(p<0.01),ApSpBS-CBP组生长抑制率明显高于RNApolBS-CBP组,有显著性差异(p<0.05)。流式细胞术结果显示ApSpBS-CBP组、RNApolBS-CBP组A549细胞坏死和凋亡率总和明显高于Scrambled ODN-CBP和CBP组,有极显著性差异(p<0.01),ApSpBS-CBP组坏死和凋亡率总和明显高于RNApolBS-CBP组,有显著性差异(p<0.05)。结论:转染ApSpBS、RNApolBS后,A549细胞中GSTP1表达水平明显下降,靶向GSTP1基因的TFBS和RNA聚合酶结合位点的寡核苷酸序列均有效地抑制了GSTP1基因的表达,增强了A549细胞对卡铂的化疗敏感性。
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