食管癌是一种常见的消化道肿瘤,统计资料显示,全世界每年约30万人死于食管癌[1-2]。我国是食管癌高发地区,每年因食管癌死亡者约15万人,约占全部癌症患者死亡人数的四分之一,死亡率位居第二位。目前手术切除是治疗本病的主要方法,早期切除常可达到根治效果,其5年生存率可达90%,因此早期发现、早期诊断、早期手术治疗是一个行之有效的措施。但是,由于口前的诊疗水平所限,患者就诊时往往病患多已属中晚期,诊疗效果大打折扣,为提高食管癌的早期诊断水平,遴选新的肿瘤相关指标,具有重要的临床意义。肿瘤的衍生和进展,是一个多基因、多步骤的演进过程,对于食管癌而言,其衍生进展的过程与许多抑癌基因、原癌基因以及凋亡基因的生物活性改变相关,但是至今还不能明确肯定那一个单一基因与食管癌的发生、进展具有特异的相关性,许多候选基因在食管癌演进过程中的作用机理尚有待进一步阐明。hClock是Takahashi于1997年首先成功克隆的一种近日钟基因家族成员[6],该基因家族通过自身的表达调控形成自激振荡,完成对机体的生物节律调控,研究发现近日钟基因不仅与近日节律的变化有关,还维持生物体正常的生命活动。目前已发现10种近日钟基因：hClock、hBmall、hHcry1、hHcry2、hPer1、hPer2、hPer3、 hDec1、hDec2和hTim3,其中hBmall基因与hClock基因是一对分子伴侣,它们结合在一起构成了异二聚体,共同介导并调控其他钟基因的转录过程,由此看出hClock基因在生物钟基因家族中起着核心作用,地位尤为重要。p16基因是1993年由serrano最早分离和鉴定的[40],位于人染色体9p21,包含3个外显子,编码由156个氨基酸残基组成,分子量约为16kD的P16蛋白,p16基因也被称为多肿瘤抑制基因1(multiple tumorsuppressor gene1, MTS1),是人体中最重要的抑癌基因之一。相关的研究表明,约有75%的癌细胞株有p16基因的突变和缺失,均会导致相关P16蛋白的合成障碍,使细胞增殖失控而发生癌变。hClock蛋白和P16蛋白是参与细胞周期节律调控的基因表达产物,而各种肿瘤的发生也与细胞周期节律异常关系密切。新的研究表明,hClock与p16参与了食管癌的演进过程,hClock蛋白在食管癌的演进发展过程中表达呈现正向增高,而P16蛋白在食管癌的发展过程中表达呈减低趋势。本研究通过应用免疫组织化学SP法观察hClock蛋白和P16蛋白在食管癌组织及正常食管组织中的表达,并分析其在食管癌发生和发展及肿瘤转移、病理分级、临床分期中的关系,探讨hClock可能作为致癌基因及p16作为抑癌基因在食管癌的诊断和治疗的临床价值,研究食管癌的发病机制,为其治疗提供新的靶点。材料与方法本实验选取泰安市中心医院肿瘤外科自2012年11月至2013年6月收治的36例食管癌病人,病人均经过手术治疗,切除的食管癌标本经两名病理科医师独立诊断证实为食管鳞状细胞癌,36例标本中癌组织作为实验组,相应标本的上切缘组织即距肿瘤5cm以上的正常食管组织作为实验对照组进行配对分组研究。应用免疫组织化学SP法检测hClock蛋白和P16蛋白在食管癌组织及与其配对正常组织中表达的差异,探讨两者在肿瘤演生、进展过程中的作用。采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计学分析,hClock、p16与食管癌临床病理因素之间的分析采用行X2检验。hClock与p16表达的相关性采用Spearman等级相关分析,以a=0.05作为统计学检验水准。结果1.36例食管癌中,hClock蛋白呈高表达,表达阳性者为34例,阳性表达率为94.44%,正常食管粘膜组织中hClock蛋白表达阳性为28例,阳性表达率为72.22%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。2. hClock蛋白表达与食管癌的肿瘤的大小、淋巴结转移程度、病理分期、性别、年龄没有统计学意义上的相关性。肿瘤的大小：TI+T2组和T3+T4组的阳性率分别为94.12%和94.74%,两组差异不具有统计学意义(P>0.05)；淋巴结转移程度：N0+N1组与N2+N3组的阳性表达率分别为92.59%和100%,两组差异不具有统计学意义(P>0.05)；病理分期Ⅰ期与Ⅱ期及Ⅰ期与Ⅲ期+Ⅳ期间比较具有统计学意义(P<0.05)。Ⅱ期与Ⅲ期比较无统计学意义。3.P16蛋白在食管癌中呈低表达,阳性表达率为63.89%(23/36)。在36例食管癌旁正常组织中,可见高表达,阳性率为88.89%(32/36)二者有显著差别(P<0.05)；4.P16蛋白与食管癌的癌组织肿瘤的大小具有相关性：T1+T2组和T3+T4组的阳性率分别为82.35%和47.37%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)；与食管癌的淋巴结转移具有相关性,NO-1组和N2-3组的阳性率分别为74.07和33.33,差异具有统计学意义(P<0.05)。5. hClock和p16的表达在食管癌组织中具有负相关性,36例食管癌组织中,hClock和p16同时表达为阳性者占13.89%(5/36),hClock和p16都表达为阴性者占2.78%(1/36),经统计分析：hClock和p16表达呈负相关性(rs=-0.347,P<0.05)。结论1.hClock蛋白在食管癌组织中的阳性表达率高于正常食管组织,P16蛋白在食管癌中呈低表达。2.hClock蛋白的阳性表达与临床分期及肿瘤大小、淋巴结转移无统计学差别。3.P16蛋白在食管癌中的阳性表达与肿瘤大小分期及淋巴结转移密切相关。4. hClock和p16的表达在食管癌组织中具有负相关性,说明hClock和p16在食管癌中的发生发展中起的作用相反。