研究背景肺癌是一种严重危害人类生命健康的重大疾病。在所有恶性肿瘤中,肺癌是全球范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌按组织病理学类型分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)(约占全部病例的80%)和小细胞肺癌(SCLC)(约占20%)。放疗是NSCLC的重要治疗手段。然而,不同NSCLC患者在放疗后疗效及预后存在显著差异,提示个体间NSCLC细胞对放疗的敏感性存在显著不同。大样本前瞻性多中心临床研究显示,单纯提高放疗剂量不能显著改善NSCLC患者预后。因此,如何提高NSCLC细胞的放疗敏感性已成为放射肿瘤学研究的核心科学问题之一。转录中介体复合物(Mediator)是一种重要转录共激活因子,参与调控人类所有编码基因转录。人类Mediator由约30个亚基组成,结构上分为CDK8激酶模块和核心Mediator两部分。Mediator结构完整性对于其发挥基因表达调控功能至关重要。研究表明Mediator结构破坏可造成其转录调控功能障碍,细胞中癌基因的表达失调,最终导致细胞恶变及肿瘤发生。MED13L是Mediator复合物的组成亚基之一,然而MED13L在Mediator中的生物学功能及其在肺癌发生发展中的作用目前尚不清楚。miRNA(microRNA)是一类进化上高度保守的短链非编码RNA。miRNA可在转录后水平通过其种子序列以完全或部分碱基互补匹配的方式与信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3’-UTR)结合,负性调节mRNA的稳定性或抑制mRNA的翻译,从而实现转录后抑制靶基因表达的作用。虽然研究显示miRNA参与调控肺癌的发生发展,系统鉴定放疗导致肺癌细胞miRNA表达谱改变及相关miRNA调控肺癌细胞放疗敏感性的具体分子机制仍不清楚。研究目的本研究通过系统鉴定放疗导致的NSCLC细胞miRNA表达谱改变,进而揭示了相关miRNA影响NSCLC放疗敏感性的分子机制,研究结果为进一步阐明调控NSCLC放疗敏感性的分子机制提供了理论支撑和依据。研究方法1.我们应用miRNA基因表达谱分析系统鉴定了 NSCLC细胞系放疗前后差异表达的miRNA分子,进而采用实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证了上述表达谱分析结果。2.在46例接受手术治疗的NSCLC患者配对的癌组织与正常肺组织中,检测候选miRNA的表达水平。在108例接受根治性放疗或同步放化疗的Ⅲ期NSCLC患者肿瘤活检组织中检测miR-4497表达,应用log-rank检验及多因素Cox回归模型分析miR-4497表达与NSCLC患者预后的相关性。3.应用细胞计数实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验及Transwell实验探究miR-4497对NSCLC细胞系恶性表型的影响。4.NSCLC细胞转染miR-4497 mimics或inhibitors并联合不同剂量放疗,应用克隆形成实验、细胞凋亡实验及细胞周期实验,进一步揭示miR-4497对NSCLC细胞放疗敏感性的影响。5.利用miRDB、TargetScan和TargetMiner三种miRNA 靶基因在线预测软件预测miR-4497的潜在靶基因MED13L和SHOX,采用qRT-PCR及双萤光素酶报告基因实验验证预测的靶基因。6.用 qRT-PCR 及 Western blot 进一步检测 miR-4497 异常表达对MED13L mRNA及蛋白水平的影响,进而在46例接受手术治疗NSCLC患者的癌组织及正常肺组织以及108例接受根治性放疗或同步放化疗的III期NSCLC患者活检肿瘤组织中检测MED13L表达并分析miR-4497和MED13L表达量的相关性。7.分析46例接受手术治疗的NSCLC患者配对的癌组织及正常肺组织中MED13L的表达情况。在108例接受根治性放疗或同步放化疗的III期NSCLC患者中,应用log-rank检验及多因素Cox回归模型分析活检肿瘤组织中MED13L表达与NSCLC患者预后的相关性。8.应用细胞计数实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验、划痕愈合实验及Transwell实验探究MED13L对NSCLC细胞系恶性表型的影响。9.利用慢病毒载体构建过表达miR-4497NSCLC细胞和稳定沉默MED13LNSCLC细胞,进而使用上述细胞建立裸鼠移植瘤模型,考察过表达miR-4497和沉默MED13L及其联合放疗对NSCLC移植瘤生长的影响。10.免疫共沉淀实验(IP)探究MED13L在Mediator中的关键桥梁功能以及MED13L与组蛋白乙酰转移酶P300之间的相互作用。11.应用过表达miR-4497及MED13L siRNA对肺癌细胞系进行MED13L沉默后,利用ChIP-Seq实验(染色质免疫共沉淀-高通量测序)揭示沉默MED13L导致的NSCLC细胞中全基因组范畴内染色质组蛋白H3K27ac修饰变化情况。12.通过韦恩分析发现过表达miR-4497组及转染MED13L siRNA组共有的H3K27ac修饰具有显著变化的基因。针对上述基因进行KEGG通路分析,发现与NSCLC发生发展密切相关的ErbB信号通路中的5个基因H3K27ac修饰发生显著变化。采用qRT-PCR和/或Western blot验证上述基因转录起始位点附近H3K27ac修饰水平变化是否影响其基因表达,确定候选基因PRKCA和ARAF。分析46例接受手术治疗的NSCLC患者配对的癌组织及正常肺组织中PRKCA和ARAF的表达情况,最终确定PRKCA为候选基因。13.采用ChIP-qPCR实验进一步探究乙酰转移酶P300是否参与NSCLC细胞中PRKCA调控区的H3K27ac修饰。14.在108例接受根治性放疗或同步放化疗的Ⅲ期NSCLC患者中,应用log-rank检验及多因素Cox回归模型分析活检肿瘤组织中PRKCA表达与NSCLC患者预后的相关性。构建慢病毒稳定沉默PRKCA NSCLC细胞,应用细胞计数实验、平板克隆形成实验探究PRKCA对NSCLC细胞系恶性表型的影响。15.利用上述稳定沉默PRKCA NSCLC细胞建立裸鼠移植瘤模型,考察沉默PRKCA及联合放疗对NSCLC移植瘤生长的影响,从而揭示PRKCA对NSCLC放疗敏感性的影响。研究结果1.在本研究中,我们通过miRNA基因表达谱分析发现,放疗可诱导A549和H1299 NSCLC细胞中miR-4497表达显著上调。在46例NSCLC患者配对的癌组织与正常肺组织中,miR-4497在癌组织中的表达显著低于在正常组织中的表达(P<0.001)。对108例接受根治性放疗或同步放化疗的Ⅲ期NSCLC患者的生存分析结果显示,miR-4497高表达组患者的PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)与miR-4497低表达组患者相比均显著延长(P<0.001)。Cox多因素分析表明,miR-4497是患者PFS及OS的独立预后因素。体外研究显示,过表达miR-4497能够显著抑制PC9、A549和H1299 NSCLC细胞的增殖能力、克隆形成能力及迁移侵袭能力;相反地,沉默miR-4497表达能够显著增强NSCLC细胞的增殖能力、克隆形成能力及迁移侵袭能力。此外,平板克隆形成实验、细胞凋亡实验和细胞周期实验结果表明,过表达miR-4497并联合放疗显著增强NSCLC细胞的放疗敏感性;相反地,NSCLC细胞中沉默miR-4497并联合放疗可导致NSCLC细胞发生放疗抵抗。2.利用 miRNA 靶基因在线预测软件 miRDB、TargetScan 和 TargetMiner 预测 miR-4497的靶基因,发现潜在靶基因MED13L和SHOX,并采用双萤光素酶报告基因实验、qRT-PCR及Western blot验证上述靶基因。研究结果显示,miR-4497可转录后显著沉默MED13L表达,但不影响SHOX表达。在46例接受手术治疗NSCLC患者的癌组织及正常肺组织以及108例接受根治性放疗或同步放化疗的Ⅲ期NSCLC患者活检肿瘤组织中检测MED13L表达,发现miR-4497和MED13L的表达量呈显著负相关,进一步验证了 miR-4497和MED13L间的负性调控关系。MED13L在NSCLC组织中的表达显著高于在正常肺组织中的表达(P<0.001)且MED13L高表达与患者放疗预后不良显著相关(P≤0.001)。细胞实验结果显示,沉默MED13L表达可显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性表型。3.动物实验结果显示,过表达miR-4497及稳定沉默MED13L的NSCLC移植瘤的生长与对照组移植瘤相比均得到显著抑制。在对过表达miR-4497及稳定沉默MED13L的NSCLC移植瘤进行X射线照射后,移植瘤的生长得到更进一步的抑制,肿瘤体积显著减小。移植瘤HE染色、Ki67及MED13L免疫组化结果也支持上述结论。4.IP结果表明MED13L可作为Mediator复合物中连接CDK8激酶模块与核心Mediator的重要桥梁蛋白,但不影响CDK8激酶模块与核心Mediator各自的结构完整性。进一步研究显示,MED13L可通过MED12与P300发生相互作用。ChIP-Seq结果显示,过表达miR-4497或沉默MED13L的NSCLC细胞全基因组范畴内染色质组蛋白H3K27ac修饰水平显著下调,进而导致ErbB信号通路中的多个癌基因的增强子和/或启动子活性降低,并显著抑制以PRKCA为代表的多种癌基因表达。ChIP-qPCR结果显示,P300可以直接结合在PRKCA转录起始位点附近的基因表达调控区域。NSCLC细胞中过表达miR-4497或沉默MED13L后,P300在PRKCA表达调控区的募集显著下调。上述结果表明,基因沉默MED13L可导致Mediator复合物中CDK8激酶模块与核心Mediator两部分间的连接解体、Mediator复合物通过CDK8激酶模块募集至染色质上的P300蛋白减少,组蛋白乙酰转移酶P300对PRKCA基因的H3K27ac修饰水平下降,进而抑制NSCLC细胞中癌基因PRKCA的表达。5.与正常肺组织相比,PRKCA在NSCLC组织中高表达(P<0.001)且与患者接受放疗后的预后不良显著相关(P<0.001)。细胞及动物实验表明,沉默PRKCA表达可显著提高NSCLC的放疗敏感性。裸鼠移植瘤HE染色及Ki67、PRKCA免疫组化结果也支持上述结论。结论本研究发现放疗诱导miR-4497表达上调可通过沉默MED13L表达进而调控Mediator复合物介导的NSCLC细胞表观遗传修饰,导致PRKCA等癌基因的表达下调并增加NSCLC放疗敏感性,研究结果将有望为肺癌放疗增敏药物研发及临床治疗提供新靶点和新策略。