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细胞自噬(autophagy)是一种真核生物中普遍存在的细胞生物学行为，是将细胞内衰老的蛋白质或损失的细胞器进一步降解回收的代谢过程。它不仅维持细胞内稳态，促进细胞的分化和发育，还在营养匮乏时帮助细胞缓解饥饿压力。 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种呈世界性分布的广泛存在于人和动物细胞内的寄生原虫，它能感染几乎所有有核细胞，而且感染效率很高，可引起严重的人兽共患寄生虫病，即弓形虫病(toxoplasmosis)，对孕妇、免疫抑制或免疫缺陷病人以及动物的影响尤为严重，可导致其死亡。目前对弓形虫病的治疗仍以化学药物为主，如乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、乙酰螺旋霉素、阿托伐醌等，但大量体外实验已证实这些药物并不能完全杀灭宿主体内的病原体，甚至使疾病转为隐形感染阶段，而研究发现自噬与弓形虫的生长发育密切相关，故调控自噬可能成为治疗弓形虫病的新方向。 本实验通过Blast软件与自噬研究较为深入的酵母自噬相关基因进行蛋白质序列相似性比对发现，刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）体内存在着三个高度同源的自噬相关蛋白，分别是TgATG8(Toxoplasma gondii autophagy-related geneprotein8，TgATG8)、TgATG3及TgATG7。透射电镜证明弓形虫体内自噬现象的存在。为了进一步研究弓形虫自噬机制以及这三个蛋白的功能，通过分子克隆的方法分别构建TgATG8及TgATG3原核表达质粒，利用表达的相应重组蛋白制备了兔抗TgATG8多克隆抗体及兔抗TgATG3多克隆抗体，与此同时，还利用不依赖连接酶的克隆方法(Ligation-independent cloning，LIC)构建pLIC-TgATG7-HA质粒，经电转及同源重组单交叉原理获得了ATG7-HA转基因虫株，这些抗体及转基因虫株都将成为弓形虫自噬机制研究的有利工具。 目的： 制备特异性抗TgATG8多克隆抗体及特异性抗TgATG3多克隆抗体，构建ATG7-HA转基因虫株，用于弓形虫自噬机制研究。 方法： 1.生物信息学方法分析弓形虫基因组中自噬相关蛋白的基因序列和氨基酸序列。 2.透射电镜观察自噬前后弓形虫超微结构的变化。 3.弓形虫抗ATG8多克隆抗体的制备 3.1以弓形虫RH株cDNA为模板，常规分子克隆方法构建pGEX-6p-1-TgATG8重组质粒，转化入大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21。 3.2经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签亲和层析法纯化表达产物。 3.3以纯化的TgATG8蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔，获得特异性抗TgATG8多克隆抗体。 3.4以制备的多克隆抗体作为一抗进行Western blotting与IFA检测。 4.弓形虫抗ATG3多克隆抗体的制备 4.1以弓形虫RH株cDNA为模板，常规分子克隆方法构建pET28a-TgATG3重组质粒，转化入大肠埃希菌(Escherichiacoli)Rosatte。 4.2经自诱导培养基诱导表达，用镍柱亲和层析法纯化表达产物。 4.3以纯化的TgATG3蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔，获得特异性抗TgATG3多克隆抗体。 4.4以制备的多克隆抗体作为一抗进行Western blotting与IFA检测。 4.5收集自噬诱导前后的GFP-ATG8虫株，与抗GFP Beads免疫共沉淀后保留上清，以制备的多克隆抗体作为一抗对上清中ATG3蛋白进行Western blotting检测。 5.ATG7-HA转基因虫株的构建 5.1以弓形虫RH株DNA为模板，利用LIC方法构建pLIC-TgATG7-HA质粒。 5.2将质粒经电转法转染弓形虫，乙胺嘧啶筛选阳性单克隆。 5.3 IFA和Western blotting鉴定新虫株构建成功。 结果： 1.序列相似性比对发现，刚地弓形虫体内存在着TgATG8、TgATG3及TgATG7这三个高度同源的自噬相关蛋白。 2.透射电镜发现自噬诱导后弓形虫胞浆内有自噬体(autophagosomes，Ap)样结构和自噬降解泡样结构(autophagic degradative vacuoles，Av)存在。 3.测序结果证实原核表达质粒pGEX-6p-1-TgATG8构建成功。Western blotting结果证实，所制备的多克隆抗体能特异性识别虫株体内天然的TgATG8蛋白。IFA实验表明，TgATG8均匀分布于虫体胞浆中，但在自噬诱导培养16h后，TgATG8逐渐聚集成颗粒状。 4.测序结果证实原核表达质粒pET28a-TgATG3构建成功。Western blotting结果证实，所制备的多克隆抗体能特异性识别虫株体内天然的TgATG3蛋白。IFA结果表明TgATG3分布于虫体胞浆中。与抗GFP-Beads免疫共沉淀后，自噬诱导组上清中无TgATG3蛋白信号。 5.测序结果证实pLIC-TgATG7-HA质粒构建成功。IFA实验表明，ATG7-HA转基因虫株体内可见绿色荧光。利用抗HA抗体进行Western blotting检测在目的大小有特异性识别。 结论： 弓形虫体内有自噬现象的存在，本实验制备的弓形虫抗ATG8多克隆抗体及抗ATG3多克隆抗体均能特异性识别内源性TgATG8蛋白及TgATG3蛋白，ATG7-HA转基因虫株构建成功，为进一步进行弓形虫自噬研究奠定了实验基础。