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缓激肽Ⅰ型受体(B1 bradykinin receptor, BDKRB1/B1R)和Apelin受体(putative receptor protein related to AT1,APJ)都是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)超家族成员,它们在心血管系统和中枢神经系统的调节过程中发挥重要作用。二者能否形成异源二聚体发挥生理作用尚未见报道。本课题试图探讨B1R和APJ能否形成异源二聚体,研究该异源二聚体对细胞内信号传导功能的影响,为B1R和APJ参与的相关生理功能的细胞内分子机制提供实验依据,为探讨相关疾病发生的分子机制提供资料。本研究有助于探寻相关疾病治疗的新突破点。 本实验通过构建含人B1R和APJ的重组表达载体,将重组载体转染到人胚胎肾(human embryonic kidney, HEK293)细胞后,使用激光共聚焦显微镜技术和Western blot技术验证B1R和APJ受体的表达,然后使用激光共聚焦显微镜技术和荧光共振能量转移技术(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)验证B1R和APJ之间能否形成异源二聚体,并且初步研究了B1R和APJ形成异源二聚体对信号传导的影响。 本研究采用分子克隆方法,首先PCR技术扩增目的片段,然后限制性内切酶酶切扩增片段和载体,酶切后T4 DNA连接酶连接成重组质粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1,并经测序验证。重组质粒转染HEK293细胞,用Western blot和激光共聚焦鉴定重组质粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1在HEK293细胞中的表达及定位。 在验证受体表达及定位正确的基础上,使用激光共聚焦显微技术验证重组质粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1的共定位,结果显示B1R和APJ都在细胞膜上表达,二者定位高度一致,初步认为B1R和APJ可能会发生相互作用。 利用上述质粒转染HEK293细胞,24小时后,利用FRET技术检测APJ和B1R之间FRET信号的强度。结果显示实验组FRET强度明显高于对照组,证实B1R和APJ之间发生了异源二聚化。 实验结果证实B1R和APJ在HEK293细胞中发生了二聚化作用,据此推测B1R和APJ的结合可能会改变胞内信号传导途径,于是本实验对细胞的增殖以及胞内Ca2+进行了研究。 细胞增殖的检测:重组质粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1单独转染或者共同转染HEK293细胞,使用CCK8试剂分别处理1小时和24小时后,使用酶标仪检测细胞数目。结果表明细胞增殖的比率明显升高,说明APJ和B1R发生二聚化后,促进细胞的增殖。 Ca2+的检测:重组质粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1单独转染或者共同转染HEK293细胞,使用BRET技术检测Ca2+荧光值。结果发现APJ和B1R发生二聚化后有明显的Ca2+增加,提示受体的二聚化可能会促进胞内Ca2+水平的增加。 本研究首次证实在转染APJ和B1R的细胞内信号传导过程中,APJ和B1R能形成异源二聚体,而且异源二聚体的形成会促进细胞的增殖,促进细胞内Ca2+增加。本实验对于理解APJ和B1R参与的相关生理功能的细胞内分子机制提供了新的实验依据,为新型药物的开发提供了新的可能的作用靶点,具有重要理论意义和实际推广应用价值。