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目的:高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为一种重要的晚期炎症因子，具有炎症和免疫双重调节功能，在脓毒症免疫紊乱过程中发挥重要作用。脓毒症状态下大脑神经元可释放炎症介质HMGB1，后者可产生神经毒性和神经免疫反应。除了已知的神经内分泌作用外，HMGB1是否对中枢自主神经产生一定的影响，进而调节外周免疫功能尚未见报道。我们采用大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞为体外神经细胞模型，探讨HMGB1是否对PC12细胞α7乙酰胆碱受体(α7nAChR)和胆碱能功能活性产生影响，从而为今后的体内实验奠定基础。
方法:
实验一:应用噻唑蓝(MTT)法检测HMGB1对PC12细胞增殖活性的改变，并分析时间和剂量效应关系。实验二:采用Western blot法和RT-PCR检测HMGB1对PC12细胞α7nAChR蛋白水平和mRNA表达的影响，并采用流式细胞术和免疫荧光法进行验证。同时，采用ELISA方法检测Ach、AchE和ChAT活性，以观察HMGB1对PC12细胞胆碱能功能的调控效应，并应用Western blot法分析HMGB1对PC12细胞外信号调节激酶(ERK)通路的活化情况。实验三:采用α-bungatoxin（α-银环蛇毒素）阻断α7nAChR后给予HMGB1刺激，观察上述指标的变化，明确HMGB1是否通过α7nAChR影响神经细胞功能。
结果:
1.HMGB1对PC12细胞活性的影响:结果显示，24h和48h时间点时500ng/ml浓度HMGB1明显促进PC12细胞增殖活性(P＜0.01)。72h时间点时20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml均显著促进PC12细胞的增殖反应。
2.HMGB1对PC12细胞α7nAChR表达、胆碱能功能活性的影响及其机制:(1)与对照组相比，20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml HMGB1组α7nAChR表达显著上调，且三个时间点结果基本一致，其中48h时间点500ng/ml组α7nAChR表达上调尤为明显;(2)与对照组相比，24h时间点100ng/ml、500ng/mlHMGB1组α7nAChR mRNA表达明显上调，48h时间点500ng/ml剂量组其表达亦显著上调，72h时间点20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml剂量组α7nAChR mRNA表达水平均明显增强。(3)流式细胞术和免疫荧光结果进一步证实了HMGB1刺激后PC12细胞α7nAChR表达明显上调，且HMGB1有效促进未分化型PC12细胞的突触生长。(4) HMGB1组与对照组相比，从时间和剂量效应来看HMGB1刺激后上清液中Ach含量均明显增多;AchE则呈下降趋势，尤其是24h和48h时间点显著降低，而ChAT无明显变化。(5)在24h、48h，HMGB1刺激能显著增强总ERK及ERK磷酸化水平，提示HMGB1可激活PC12细胞ERK信号通路。
3.α-银环蛇毒素阻断α7nAChR后，再给予HMGB1刺激，分析上述检测指标的变化规律:(1) HMGB1对PC12细胞活性的影响消失，提示α7nAChR参与了HMGB1促PC12细胞增殖的过程;(2) HMGB1对PC12细胞α7nAChR蛋白表达的影响与阻断前相比无明显差异，能上调α7nAChR表达，其中以100 ng/ml HMGB1组改变尤为显著，且三个时间点的结果一致。HMGB1对PC12细胞α7nAChR mRNA表达的影响与阻断前相比趋势相似，明显促进α7nAChR mRNA表达，但与阻断前比上调更显著，与蛋白水平改变一致，提示α-银环蛇毒素阻断α7nAChR后可能提高PC12细胞对HMGB1反应的灵敏性;(3) HMGB1对总ERK水平上调效应有所减弱，但p-ERK活性完全被抑制。(4) HMGB1可升高上清液中Ach含量;而对AchE的抑制作用基本消失;阻断α7nAChR后ChAT水平显著上升，给予HMGB1刺激可逆转该变化趋势。
结论:
1.HMGB1以时间依赖和剂量依赖方式促进PC12细胞增殖，证实HMGB1本身可能无明显神经毒害作用。
2.HMGB1能够以时间依赖和剂量依赖方式上调PC12细胞α7nAChR表达，提示HMGB1可显著影响神经细胞重要功能受体的表达，α7nAChR参与了中枢对炎性细胞因子的识别和反应过程;
3.HMGB1可通过α7nAChR途径激活PC12细胞ERK信号通路，进而介导其促增殖效应。
4.HMGB1刺激后PC12细胞Ach水平明显升高，而抑制AchE活性，提示HMGB1可增强PC12细胞胆碱能活性。
5.α7nAChR可能参与PC12细胞ChAT活性调节，其确切机制有待澄清。