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结核病(TB)是由结核杆菌感染引起的慢性传染性疾病,结核病对全球健康构成持久威胁,目前全球近1/3人口患有潜伏性结核病,每年有近180万人因结核病死亡。近40年内,除了贝达喹啉和德拉玛尼外没有新药的出现,因此迫切需要具有新作用机理的药物。拥有独特杀菌机理且使微生物不易产生耐药性的抗菌肽有望成为抗分枝杆菌感染的潜在药物。对实验室现有的抗菌肽进行筛选,发现D型、L型和D/L型三种构型抗菌肽W3R6对耻垢分枝杆菌(ATCC 700084)(Mycobacterium smegmatis,M.s)的最小抑菌浓度分别为6.25μM、12.5μM和6.25μM,对抗菌肽进行改造,在D型W3R6的N端链接了疏水脂肪链基团乙酰基、丁酸酰基、正辛酸酰基、月桂酸酰基和棕榈酸酰基,以期通过疏水性的调整增强抗菌活性,结果发现,AC-D-W3R6和BA-D-W3R6的MIC值均降为3.13μM,但是随着疏水性的增加,抗菌肽OA-D-W3R6、LA-D-W3R6和PA-D-W3R6的细胞毒性也逐渐增强,因此本论文选择了活性较好且细胞毒性较弱的抗菌肽W3R6及其改造肽,以分枝杆菌的实验室模式菌耻垢分枝杆菌为研究对象,探究了此类抗菌肽对耻垢分枝杆菌的作用机制,希望对抗菌肽在临床上的开发和利用提供参考。对于任何一种新型抗菌物质,其抗菌活性、稳定性和抗菌机理对其后期的开发应用都具有重要意义。抗菌肽W3R6及其改造肽的抗菌活性研究表明此类抗菌肽对分枝杆菌和胞内感染的分枝杆菌均具有较好的抗菌活性,与一线抗结核药物具有协同作用,发展耐药性结果显示此类抗菌肽与利福平相比不易产生耐药性,此外D型抗菌肽在人血清环境中显示出较强的稳定性,即使与人血清共孵育96 h也仅有轻微的降解,为其进一步研究提供参考;扫描电镜实验和Live/Dead染色实验结果提示此类抗菌肽对于分枝杆菌细胞膜的影响,Zeta电势结果表明抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌表面负电荷结合,AC-D-W3R6和BA-D-W3R6在16μM浓度时被中和,D-W3R6、L-W3R6和D/L-W3R6在浓度为32μM时被中和,NPN和去极化实验证实了抗菌肽W3R6及其改造肽使耻垢分枝杆菌内外膜的通透性增加,钙黄绿素释放实验检测抗菌肽对制备的分枝杆菌内膜模拟膜存在破坏作用,AC-D-W3R6和BA-D-W3R6浓度为12.5μM时钙黄绿素的释放率达到100%,D-W3R6和D/L-W3R6浓度为25μM时释放率达到100%,L-W3R6浓度为50μM时释放率达到100%,结果表明抗菌肽W3R6及其改造肽通过与细胞膜相互作用来发挥抗菌活性;通过激光共聚焦扫描显微镜观察到抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌的核质区存在结合,DNA的琼脂糖凝胶电泳实验的结果表明,此类抗菌肽可以不同程度地结合耻垢分枝杆菌的基因组DNA,其中与DNA的结合能力最强的L-W3R6在肽/DNA的浓度比为0.0156/1时发生结合,D/L-W3R6在肽/DNA的浓度比为0.032/1时发生结合,AC-D-W3R6和BA-D-W3R6在肽/DNA的浓度比为0.0625/1时发生结合,D-W3R6在肽/DNA的浓度比为0.125/1时发生结合,DNA紫外吸收光谱实验进一步揭示抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌的基因组DNA结合发生增色效应,阻碍分枝杆菌基因组DNA的合成。以上研究结果表明,抗菌肽W3R6及其改造肽具有良好稳定性的同时对分枝杆菌有一定的杀菌作用,此类抗菌肽的抗菌活性与其对分枝杆菌细胞膜通透性的影响和其与DNA的结合能力密切相关。