立题依据肺癌是国内外死亡率和发病率最高的恶性肿瘤类疾病,尽管针对肺癌的诊断手段和治疗方法不断革新,其远期生存期仍令人担忧,转移、耐药及疗后复发是导致其预后差的主要因素。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)理论的提出为肿瘤的发生、发展机制揭示了新的视角,为肿瘤的治疗带来了新的希望,CSCs被认为是具有异质性的肿瘤组织中的含量极少的细胞亚群,在肿瘤的发生、侵袭、转移及耐药等诸多方面都体现出强于已分化肿瘤细胞的恶性生物学特性,分选、鉴别并靶向杀伤CSCs是当前肿瘤学领域研究的热点。通过患者的临床症状、血液流变学异常、微循环障碍等表现,可以判断血瘀证是包括肺癌患者在内的恶性肿瘤患者证候群中的重要证素,血瘀证不仅是肺癌等患者常见的客观征象,也对恶性肿瘤的侵袭和转移产生协同促进作用。活血药是肺癌临床治疗处方中的重要构成部分,活血药不仅有效地改善患病机体血行状况、缓解临床症状,还对肿瘤细胞的增殖、周期、侵袭、转移等产生一定的影响。在前期研究中,我们已经证实了川芎、苏木、鸡血藤、水蛭等活血药对lewis肺癌的转移有一定的抑制作用,其抑制作用机理可能与影响CD44V6、p-选择素、CD29、E-Cad、HIF-1α等蛋白表达有关,同时,我们也发现苏木、鸡血藤等活血药可对肺癌细胞的增殖有一定的抑制作用,其抑制作用与细胞周期阻滞及促进凋亡有关。本研究即是在前期研究的基础上,结合现在备受关注的CSCs理论,观察前期研究所用活血药川芎、丹参的有效成分川芎嗪和丹参酮ⅡA对肺癌干细胞样细胞的增殖、凋亡、粘附、侵袭、耐药及血管生成等恶性生物学行为的影响,以期从影响肺癌干细胞的角度探索活血药的作用机理和可能的作用靶点,为完善肺癌的血瘀证理论及临床合理应用活血药提供科学依据。研究目的1、分选并鉴定高转移性人肺巨细胞癌PG(分为高转移亚系PG-BE1、低转移亚系PG-LH7)中的干细胞样细胞,并探索PG原代细胞及不同氧浓度下干细胞样细胞在粘附、侵袭、耐药、血管生成等方面的差异；2、研究活血药川芎、丹参的有效成分川芎嗪及丹参酮Ⅱ A对PG干细胞样细胞增殖、凋亡、粘附、侵袭、血管生成、耐药等的影响。研究方法1、采用无血清成球培养法分选PG-BE1、PG-LH7细胞系中的干细胞样细胞亚群,并采用平板克隆形成实验、细胞凋亡检测、细胞周期检测及干细胞相关标志(CD133、SOX-2、OCT-4、Nanog)检测等验证其干性；2、采用MTT实验观察不同浓度梯度川芎嗪、丹参酮ⅡA在24h、48h、72h等不同时间点上对PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞增殖的影响；3、采用人造基底膜粘附实验检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞的粘附能力,采用免疫荧光染色法检测上述各组细胞CD29、CD44V6蛋白的表达,采用Western blot法检测各组细胞CD29、CD44V6蛋白的表达量；4、采用Transwell小室侵袭实验检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞的侵袭能力,采用免疫荧光染色法检测上述各组细胞E-Cad、N-Cad、 Vimentin、MMP-2等蛋白的表达,采用Western blot法检测各组细胞E-Cad、N-Cad、 Vimentin、MMP-2等蛋白的表达量；5、采用ELISA实验检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BEl和PG-LH7干细胞样细胞的VEGF的表达,采用Western blot法检测各组细胞HIF-1α蛋白的表达量,采用RT-PCR实验检测各组细胞VEGF、HIF-1α mRNA的表达；6、采用MTT实验检测PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞对常用化疗药顺铂、吉西他滨及紫杉醇的耐受能力,采用Western blot法检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞的耐药相关蛋白ABCG2的表达,采用RT-PCR实验检测各组细胞ABCG2 mRNA的表达。研究结果1、采用无血清成球培养法培养的PG-BE1及PG-LH7细胞在培养至第4天开始出现较规则的球体,培养至第6天球体表面颜色变暗、折光性降低；平板克隆形成实验结果显示PG-BEl成球细胞与原代细胞的克隆灶形成数目分别为(8.06±1.31)个、(3.94±1.06)个,两者差异有统计学意义(p<0.001)。PG-LH7成球细胞与原代细胞的克隆灶形成数目分别为(6.06±1.35)个、(2.67±1.33)个,两者差异有统计学意义(p<0.001)；PG-BE1成球细胞与原代细胞CD133表达分别为(7.158±4.209)%、(0.838±0.649)%,两者差异有统计学意义(p=0.028)。PG-LH7成球细胞与原代细胞CD133表达分别为(3.785±2.968)%、(0.653±0.311)%,两者差异无统计学意义(p=0.081)；PG-BE1成球细胞与原代细胞G0/G1期细胞比例分别为(84.04±5.27)%、(50.57±1.78)%,两者差异有统计学意义(p<0.001)。PG-LH7成球细胞与原代细胞GO/G1期细胞比例分别为(54.06±2.51)%、(55.71±1.29)%,两者差异无统计学意义(p=0.366)；PG-BE1成球细胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率均低于原代细胞,p值分别为：0.021、0.001、<0.001。PG-LH7成球细胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率亦低于原代细胞,p值均为0.002；PG-BE1成球细胞表面干细胞表面标志SOX-2、OCT-4及Nanog的表达强于其亲代细胞,p值分别为0.017、0.01、0.029；PG-LH7成球细胞表面干细胞表面标志SOX-2、OCT-4及Nanog的表达亦强于其亲代细胞,p值分别为0.001、0.032、0.044。2、川芎嗪作用PG-BE1干细胞样细胞24h、48h后,随药物浓度增加而抑制作用增强,当川芎嗪浓度达到300μg/ml后,抑制作用增强不明显。不同浓度的川芎嗪的抑制增殖作用均有时效关系；川芎嗪对PG-LH7干细胞样细胞的抑制作用在不同时间上均存在量效关系。10μg/ml、50μg/ml浓度川芎嗪在48h时作用最强,100μg/ml、300μg/ml、500μg/ml浓度组随时间延长,抑制作用增强；丹参酮ⅡA对PG-BE1干细胞样细胞的增殖抑制作用存在量效关系。浓度为0.25μg/ml、0.50μg/ml的丹参酮ⅡA随作用时间延长而有更强的抑制增殖能力；0.75μg/ml、1.00μg/ml、1.25μg/ml的丹参酮ⅡA在作用时间为48h时抑制作用最强；丹参酮ⅡA对PG-LH7干细胞样细胞的增殖抑制作用存在量效和实效关系。3.PG-BE1及PG-LH7干细胞样细胞的粘附能力均强于其原代细胞,其p值分别为0.013、0.005；PG-BE1及PG-LH7干细胞样细胞在不同氧浓度环境下的粘附能力均无差异,其p值分别为0.74、0.151；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1干细胞样细胞的粘附能力,且不同浓度川芎嗪的抑制作用呈现剂量依赖性,中、高浓度丹参酮ⅡA的抑制作用强于低浓度,中、高浓度之间抑制作用无差异(p=0.588)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-LH7干细胞样细胞的粘附能力,不同浓度川芎嗪的抑制作用无差异,中、低剂量丹参酮ⅡA的抑制作用弱于高剂量,中、低剂量之间抑制作用无差异(p=0.585)。PG-BE1干细胞样细胞的CD29及CD44V6表达均强于其原代细胞(p<0.001)；PG-BE1干细胞样细胞在不同氧浓度下的CD29表达无差异(p=0.188),PG-BE1干细胞样细胞在常氧环境下CD44V6的表达量高于低氧环境(p<0.001)；PG-LH7干细胞样细胞的CD44V6表达量高于原代细胞(p=0.028),CD29的表达与原代细胞无差异(p=0.302)；PG-LH7干细胞样细胞在常氧环境下CD29的表达量高于低氧环境(p=0.004),而CD44V6在不同氧环境下表达无差异(p=0.071)；不同浓度的川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1干细胞样细胞CD29的表达,川芎嗪及丹参酮ⅡA的抑制作用均无剂量依赖性；高浓度川芎嗪及不同浓度丹参酮ⅡA可抑制PG-BE1干细胞样细胞CD44V6的表达,丹参酮ⅡA的抑制作用存在剂量依赖性；不同剂量川芎嗪及丹参酮ⅡA对PG-LH7干细胞样细胞CD29的表达均无抑制作用。但可抑制CD44V6的表达,不同浓度之间的抑制作用无剂量相关性。4、PG-BE1及PG-LH7干细胞样细胞的侵袭能力均强于其原代细胞(p<0.001),低氧环境中的PG-BE1干细胞样细胞侵袭能力强于常氧环境(p=0.038),PG-LH7干细胞样细胞在不同氧环境下侵袭能力无差异(p=0.406)；PG-BE1干细胞样细胞E-Cad、N-Cad表达强于原代细胞(其p值分别为0.003、<0.001),PG-LH7干细胞样细胞Vimentin的表达强于原代细胞(p值为0.032)；低氧环境下mPG-BE1干细胞样细胞的E-Cad表达下调(p<0.001),N-Cad、Vimentin、MMP-2的表达上调(p值均小于0.05)。PG-LH7干细胞样细胞N-Cad、Vimentin、MMP-2的表达均上调(p值均小于0.05)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1干细胞样细胞的侵袭能力(各组与空白组相比,p值均小于0.05),不同浓度川芎嗪的抑制作用有剂量依赖性,中、低浓度丹参酮ⅡA的抑制作用弱于高浓度,低、中浓度之间比较差异无统计学意义(p=0.349)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-LH7干细胞样细胞的侵袭能力,川芎嗪及丹参酮ⅡA的抑制作用均无剂量依赖性。川芎嗪及丹参酮ⅡA对两种干细胞样细胞侵袭能力的影响与对E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表达有关。5、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞VEGF表达均显著强于原代细胞(p<0.001),低氧环境下PG-BE1、PG-BE1干细胞样细胞VEGF表达均显著强于常氧环境(p<0.001)。不同浓度川芎嗪与丹参酮ⅡA均对PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞的VEGF表达均有一定的抑制作用,且抑制作用有剂量相关性。PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞的HIF-1α的表达均强于其原代细胞(p<0.05),PG-BE1干细胞样细胞在低氧环境下的HIF-1α的表达强于常氧环境(p<0.05),PG-LH7干细胞样细胞在低氧环境下的HIF-1α的表达与常氧环境表达无差异(p=1.0)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可对PG-BEl干细胞样细胞HIF-1α的表达产生抑制作用(p<0.05),不同浓度川芎嗪之间,抑制作用无差异(p>0.05),低、中浓度丹参酮ⅡA的抑制作用强于高浓度。不同浓度川芎嗪对PG-LH7干细胞样细胞HIF-1α的表达均无明显抑制作用。不同浓度丹参酮ⅡA均可对PG-LH7干细胞样细胞HIF-1α的表达产生抑制作用,高浓度丹参酮ⅡA的抑制强度强于低、中浓度组。川芎嗪及丹参酮ⅡA对两种细胞VEGF、HIF-1α表的抑制与其下调其mRNA表达相关。6、MTT结果显示,PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞对顺铂、吉西他滨、紫杉醇的耐受性普遍强于其原代细胞。PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞的化疗耐药性可能与其高表达ABCG-2有关(与原代细胞相比,p<0.001),此外,两种细胞在常氧环境中ABCG-2蛋白的表达量高于低氧环境(p<0.001)；川芎嗪与丹参酮ⅡA均可抑制ABCG-2蛋白表达,不同浓度抑制作用无剂量依赖性。除低剂量丹参酮ⅡA组外,各剂量川芎嗪及丹参酮ⅡA对PG-LH7干细胞样细胞ABCG-2蛋白的表达均有一定的抑制作用,不同浓度抑制作用亦无剂量依赖性。川芎嗪及丹参酮ⅡA对两种细胞ABCG-2表达的抑制与其下调其mRNA表达相关。研究结论1、采用无血清成球培养法可一定程度上分选肺癌细胞系中的CSCs亚群,可通过对其自我更新、细胞凋亡、细胞周期、表面标志等的检测验证其干性。2、川芎嗪和丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞增殖,川芎嗪抑制作用较弱,两者的抑制作用有一定的量效、时效关系。3、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞有较其原代细胞更强的人造基底膜粘附能力,川芎嗪和丹参酮ⅡA可抑制其粘附作用,其抑制作用与影响CD29及CD44V6蛋白的表达有关。4、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞有较其原代细胞更强的侵袭能力,且其侵袭能力在低氧环境中更明显,川芎嗪和丹参酮ⅡA可一定程度上抑制其侵袭能力,其抑制作用与影响E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表达有关。5、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞可能具有更强的促血管生成能力,川芎嗪和丹参酮ⅡA可通过抑制其HIF-1α及VEGF的表达而抑制其血管生成能力。6、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞耐药性更强,这与其高表达ABCG-2蛋白相关,一定浓度的川芎嗪和丹参酮ⅡA可抑制ABCG-2蛋白表达。