论文部分内容阅读
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属革兰氏阴性菌，是重要的条件致病菌，能够引起鱼类的弧菌病，对海洋鱼类养殖产业造成经济损失。全面了解溶藻弧菌的致病机制将有助于开发高效疫苗。目前鉴定的与溶藻弧菌致病性相关的毒力因子有群体感应系统、分泌系统、铁载体摄取系统、运动性和生物被膜等，其中群体感应系统全局调控毒力因子的表达。溶藻弧菌群体感应系统的中枢元件AphA和LuxR是全局性的转录调控因子，可调控多种目的基因的表达，而人们对aphA和luxR本身受到哪些转录调控因子的调控作用却知之甚少。为了寻找溶藻弧菌中调控aphA和luxR的转录因子，构建了一个细菌单杂交系统。利用该系统分别筛选了aphA和luxR的转录调控因子，并对其中两个因子的调控机制进行了较为深入的分析，为解析细菌群体感应系统介导细胞密度信号和其他生理信号调控基因表达并表现多细胞群体行为打下了良好基础。 本论文首先在商业化细菌双杂交系统的基础上改造得到一个新型的细菌单杂交系统，并构建了含有285个基因的溶藻弧菌转录因子文库。从文库中，分别筛选到了99个aphA的转录调控因子及76个luxR的转录调控因子，它们分布于各个不同的转录因子家族，其中为数最多的是LysR家族。通过比较发现aphA与luxR的共转录调控因子为53个，对其中3个基因soxR、metR及asnC进行了蛋白表达纯化，并分别与aphA及luxR启动子进行了EMSA实验，结果显示这三个转录因子均能与aphA及luxR启动子结合。此外，对包括soxR、metR及asnC在内的7个转录调控因子进行了缺失株构建，通过HPA及western实验鉴定其对溶藻弧菌的毒力蛋白Asp具有显著的影响。 通过细菌单杂交实验AphB蛋白被鉴定为luxR的LysR型转录调控因子，并通过EMSA实验得到进一步的证实。借助DNaseⅠfootprinting实验鉴定到AphB结合于luxR启动子的-83～-66bp区域，恰好位于LuxR自身结合位点(RBSI)的中间，处于AphA蛋白结合位点的下游。AphB与luxR启动子的结合受到LuxR蛋白的影响。ChIP-seq实验发现AphB可与20个基因片段直接结合，参与细胞的多种代谢途径，结合基序为TGCAGN7TGTTG。AphB能够自我激活转录，还可通过调控cyaA影响生物被膜形成，调控cadB介导细菌的酸性应激响应机制。总之，AphB是一个全局性的转录调控因子，介导环境信号分子与群体感应系统的调控关系。 细菌单杂交系统筛选到另一个新型转录因子，EPGS_18672，为LysR型家族，是aphA和luxR的共转录因子。EPGS_18672蛋白通过结合启动子区域分别抑制aphA及激活luxR的转录，同时受到两者的反馈调控。EPGS_18672转录调控因子可通过结合自身启动子的对称回文序列抑制自身转录。杀菌实验及对斑马鱼的毒力检测，发现EPGS_18672转录调控因子的缺失，可使溶藻弧菌丧失杀菌功能，并降低对斑马鱼的毒力。此外，18672蛋白影响毒力蛋白的表达。基于LysR家族蛋白能够感应不同的外界信号，如其中EPGS18672可能响应与细胞或其他分子表面的接触作用，AphB则能响应活性酸应激，群体感应系统的表达受到以往未知的更多胞外信号的调控作用。