脾阳虚证存在两症状群：①阳虚症状群,表现是畏寒喜温、形寒肢冷、蜷缩倦怠等。中医理论基础是脾失温煦,而生物学基础是能量代谢低下、产热不足；②脾(气)虚症状群,表现是纳少、消瘦、乏力、脘腹胀痛、便溏及腹泻等。中医理论基础是脾失健运,而生物学基础是胃肠消化和吸收功能减退。简而言之,该两大症状群可概括为“不温”和“不运”症状群。一、本研究首先系统综述了脾阳虚证理论研究进展、脾阳虚证实验研究进展和脾阳虚证神经内分泌研究进展。重点介绍了脾阳虚证动物模型制备的现状、缺陷与发展方向,系统概述了解偶联蛋白家族(uncoupling proteins, UCPs)在能量代谢(特别是产热)中的作用特点,概括了新的脑肠肽胃生长素(ghrelin)对胃肠消化吸收功能和摄食、能量代谢双重调控的特点。这些进展为本研究寻找创新点提供了前提条件。二、实验研究设计的基本思路以研创“新型脾阳虚模型”为基点,瞄准脾阳虚证能量代谢改变特征,探索脾阳虚证中最为关键的“阳虚”机制；以现代系统生物学“整体论”思想为理论基础,探索脾阳虚证中桥联“脾失健运”(“不运”)和“脾失温煦”(“不温”)两大板块(症状群)的神经内分泌调控因素。(一)建立新型脾阳虚证动物模型本研究采用肩胛间棕色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT)切除术+高脂饲料喂养+隔日寒冷环境刺激的复合因素造模方法,建立了可靠的脾阳虚证动物模型。其主要特色是加强了“伤阳”设计,通过切除BAT,大幅度减少大鼠产热来源,衰其阳气,使脾阳虚证动物模型造模的阳虚环节坚实,该方法具有创新性。(二)脾阳虚证的能量代谢研究脾阳虚证患者有形寒肢冷、畏寒喜温等症状和体征,和现代医学理论中的基础代谢率和能量代谢水平下降而导致的产热不足表现相似,从现代生物化学观点看,细胞的物质代谢活动都伴随有能量转化,而三磷酸腺苷(ATP)是机体储能和直接供能的物质,因此,了解脾阳虚证大鼠荷能物质(糖和脂肪)水平、能荷和ATP酶的改变特征对于阐释脾阳虚证阳虚的本质具有重要的意义。线粒体是细胞能量代谢和生物氧化的主要场所,UCP约占线粒体内膜蛋白总量的6%-14%,与机体产热作用密切相关。现代生物学研究显示其生理作用是使线粒体膜电位降低,使物质氧化磷酸化和ATP合成解偶联,从而抑制ATP的合成,使能量以热能形式散失,使呼吸过程中由质子梯度形成的电化学势能转变为热能而不产生ATP,即产热而不产能,由于UCP对能量代谢的潜在影响,脾阳虚既然有产热低下的表现,理论上应该和UCP的表达异常有关。本课题拟检测血糖、血脂、线粒体能荷、线粒体UCP和骨骼肌肌球蛋白ATP酶活性等能量代谢相关指标,研究脾阳虚证大鼠能量代谢的特征,探讨脾阳虚证阳虚的细胞分子机制。(三)脾阳虚证的神经内分泌研究现代生物学的最新研究进展表明脑肠肽、胃肠激素和肠神经系统递质对胃肠进行着整合控制。脾阳虚证主要是以消化系统为主的多系统、多器官的功能低下,并与相关神经内分泌调控的改变有着密切的联系,特别是近年新发现的脑肠肽Ghrelin,与胆囊收缩素相似,具有广泛的胃肠功能和摄食、能量代谢双重调控作用。有望成为连接脾阳虚消化吸收功能状态和能量代谢状况的桥梁之一因此,本课题拟检测脾阳虚Ghrelin水平,了解脾阳虚证大鼠Ghrelin改变的特征,以探讨Ghrelin作为神经内分泌物质在脾阳虚证发病机制中的作用。三、实验研究结果(一)异丙肾上腺素致脾阳虚证大鼠产热量效关系的实验研究1目的采用肩胛间BAT切除术+高脂饲料喂养(高脂饮食)+隔日寒冷环境刺激的多因素造模模式制备脾阳虚证动物模型,然后以异丙肾上腺素作为外部刺激源,观察脾阳虚证动物对异丙肾上腺素适应性产热的反应性和剂量效应相关性。2方法参考有关对脾阳虚证动物模型的评价,对大鼠序贯施行BAT切除、高脂饮食喂养、隔日寒冷环境刺激的措施,模拟中医学脾阳虚的发生发展过程,观察大鼠曲行为学表现,建立脾阳虚证大鼠模型,在大鼠适宜环境(28℃)下,以异丙肾上腺素对大鼠进行尾静脉注射,测定大鼠肛温、胸部体表温度、肢温,并探索异丙肾上腺素剂量和各部温度变化之间的关系。3结果异丙肾上腺素刺激大鼠产热的量效关系如下：肛温峰值和曲线下面积EDso分别为0.28 mg/kg和0.106 mg/kg,胸部体表温度峰值以及曲线下面积ED50分别为0.066 mg/kg和0.070 mg/kg,肢温峰值以及曲线下面积ED50分别为0.071mg/kg和0.172 mg/kg,肛温、肢温与胸部体表温度三部分温度之间变化趋势呈正相关。4结论(1)脾阳虚证大鼠整体上产热能力下降,可能是脾阳虚动物畏冷寒战的原因。采用药物干预可以改善适应性产热低下状况,为主要以温热药组成的附子理中汤干预脾阳虚动物的实验奠定了基础。(2)异丙肾上腺素刺激脾阳虚证大鼠产热效能,量效关系正相关,但最佳剂量受环境(如外界温度、噪音和光线等)因素影响而难以确定。(二)脾阳虚证大鼠BAT和UCP1关联性的实验研究1目的探讨BAT、解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)、高脂饮食和中药干预在实验动物能量代谢中的关联性和机制。2方法动物随机分为4组。每组16只。(1)对照组：普通饲料喂养；d70-d98生理盐水10ml/kg/d灌胃。d98检测刺激性产热,观察2h肛温变化曲线和温度峰值,计算温度曲线下面积；(2)阳虚组：d42手术切除肩胛间BAT,余同(1)组；(3)脾阳虚组：d49-d98高脂饲料(83%普通饲料,15%甘油三酯,2%胆固醇)喂养；隔日19℃环境喂养,余同(2)组；(4)中药组：d70-d98附子理中汤5ml/kg/d灌胃。余同(3)组。每周测体重一次。以效能体重增长率、效能产热温度峰值、产热温度曲线下面积为参考指标。取BAT测UCP1表达量。3结果(1)效能体重增长率阳虚组与对照组相比体重增长减慢(P＜0.01)；脾阳虚组与阳虚组相比体重增长减慢(P＜0.01)；中药组与脾阳虚组相比,体重增长加快(P＜0.01)。(2)效能产热温度峰值阳虚组与对照组相比效能产热温度峰值降低(P＜0.01)；脾阳虚组与阳虚组相比效能产热温度峰值升高(P＜0.01)；中药组与脾阳虚组相比,效能产热温度峰值升高(P＜0.01)；中药组与脾阳虚组相比,效能体重增长率与效能产热温度峰值变化程度呈正相关。(3)产热温度曲线下面积阳虚组与对照组相比产热曲线下面积减少(P＜0.01)；脾阳虚组与阳虚组相比产热曲线下面积增加(P＜0.05)；中药组与脾阳虚组相比,产热曲线下面积增加(P＜0.01)。效能体重增长率与产热温度曲线下面积变化程度呈正相关。中药组上调UCP1表达量,和阳虚组以及脾阳虚组相比,差异均具有高度显著性(P＜0.01)。4结论(1)温阳健脾中药促使高脂饮食转化为BAT并提高其产热活性。(2)温阳健脾中药上调UCP1在BAT中的表达,通过UCP1的解偶联作用,使BAT分解产热而改善阳虚畏寒的症状。(三)脾阳虚证大鼠骨骼肌线粒体能荷和UCP3的关联性研究1目的研究附子理中汤对脾阳虚证大鼠骨骼肌解偶联蛋白3(uncoupling protein3,UCP3)含量以及骨骼肌能荷的影响。2方法动物随机分为四组,每组18只,四组动物均饲以普通饲料和饮水喂养至(142,然后取三组造模,剩下一组作为对照组,对照组依然是普通饲料和饮水,对造模的三组采取以下措施：(1)d42,随机取其中一组施行肩胛间BAT切除术,术后饲以普通饮食、饮水,为阳虚组；(2)d42,余下的两组,也施行肩胛间BAT切除术,但术后饲以高脂饲料(83%基本饲料,15%甘油三酯,2%胆固醇),隔日19℃环境喂养；至d82随机从两组中取一组,每只大鼠按照5ml/kg体重每天灌饲附子理中汤,为中药组；另一组为脾阳虚组,全部四组d98取左侧腓肠肌检测指标。3结果(1)中药组肌能荷值显著低于其他三组,说明合成ATP的量低于其他三组,(和对照组相比P＜0.01；和阳虚组比,P＜0.05；和脾阳虚组比,P<0.05)。中药组UCP3表达量和ATP酶活性均较脾阳虚组升高(分别为P＜0.01,P＜0.05)。(2)脾阳虚组和对照组相比,能荷值降低(P＜0.05)；和阳虚组相比,能荷值也降低,但差异没有显著性(P＞0.05)。脾阳虚组UCP3表达量升高(与对照组相比P＜0.01)。脾阳虚组骨骼肌肌球蛋白ATP酶活性升高(与对照组相比P＜0.01)。(3)阳虚组和对照组相比,能荷值降低但差异没有显著性(P＞0.05)。4结论本实验结果表明,附子理中汤通过上调骨骼肌UCP3表达和骨骼肌肌球蛋白ATP酶活性以及抑制机体合成ATP(产能),通过UCP3解偶联作用提高产热而发挥温阳作用。(四)脾阳虚证大鼠UCP3和血糖、甘油三酯以及总胆固醇关联性实验研究1目的分析附子理中汤对脾阳虚证大鼠UCP3的影响以及UCP3和血糖、甘油三酯、总胆固醇能量物质之间的内在联系。2方法实验动物分为4组,每组16只。(1)对照组：普通饲料喂养,饮水；d70-d98灌胃生理盐水10ml/kg/d;(2)阳虚组：d42手术切除BAT,余同(1)组；(3)脾阳虚组：d49-d98高脂饲料(83%普通饲料,15%甘油三酯,2%胆固醇)在28℃和19℃环境隔日交替喂养；余同(2)组；(4)中药组：d70-d98附子理中汤5ml/kg/d灌胃；余同(3)组。全部四组动物d98左颈总动脉插管取血检测血糖、血清甘油三酯、血清总胆固醇含量,取骨骼肌检测UCP3。3结果(1)各组血糖含量的比较阳虚组与对照组相比血糖降低(P＜0.01)；脾阳虚组与阳虚组相比血糖升高(P＜0.01)；中药组与阳虚组相比,血糖升高(P＜0.01)；中药组与脾阳虚组相比,血糖血糖有下降趋势(P＞0.05)。(2)各组血清甘油三酯含量的比较阳虚组与对照组相比血清甘油三酯降低(P＜0.01)；脾阳虚组与阳虚组相比血清甘油三酯增加(P＜0.01)；中药组与阳虚组相比,血清甘油三酯升高(P＜0.01),中药组与脾阳虚组相比,血清甘油三酯有下降趋势(P＞0.05)。(3)各组血清总胆固醇含量的比较脾阳虚组、中药组与对照组相比血清总胆固醇均升高(P＜0.01)。(4)各组UCP3表达细胞形态观察①对照组UCP3表达细胞形态镜下对照组骨骼肌肌原纤维排列整齐,肌原纤维有较多阳性颗粒表达。②阳虚组UCP3表达细胞形态镜下阳虚组骨骼肌肌原纤维阳性颗粒表达较对照组少。③脾阳虚组UCP3表达细胞形态镜下脾阳虚组骨骼肌肌原纤维阳性颗粒表达较对照组少。④中药组UCP3表达细胞形态镜下中药组骨骼肌肌原纤维阳性颗粒表达较脾阳虚组和阳虚组多。(5)各组骨骼肌UCP3表达量的比较中药组、脾阳虚组、阳虚组与对照组相比,UCP3表达上调(P＜0.01)；中药组经过中药干预后,UCP3表达上调(P＜0.01)。4结论(1)附子理中汤促使骨骼肌内UCP3增加,UCP3主要促进脂肪酸代谢,使血清甘油三酯降低；增加对葡萄糖的利用及加强其代谢,使血糖水平降低。(2)脾阳虚组给于高脂饮食,血清甘油三酯升高,则游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)也增多,FFA和葡萄糖作为参与能量代谢物质,相互间存在竞争,FFA水平升高使葡萄糖氧化受抑和摄取减少,表现为血糖升高。(3)由于UCP1作用的组织是BAT, UCP3主要作用于骨骼肌,均有高度的专一性,对胆固醇代谢的作用不明显；另外,由于高脂饲料中含有胆固醇,这增加了实验动物胆固醇摄入量,以上两点是脾阳虚组和中药组血清总胆固醇水平比对照组高的原因。(4)附子理中汤上调UCP3表达量,通过UCP3对骨骼肌的解偶联作用、促进产热是引起血糖、血清甘油三酯、血清总胆固醇水平变化的核心机制。(五)附子理中汤对脾阳虚证大鼠血清胃生长素影响的实验研究1目的探讨脾阳虚证大鼠血清Ghrelin的变化特征、生理作用机制以及附子理中汤对脾阳虚证大鼠血清Ghrelin的影响。2方法实验动物体重均衡随机分为4组,每组16只。①对照组：普通饲料喂养,饮水；d70-d98灌胃生理盐水10 ml/kg/d。d98禁食12h后,尾静脉取血,：EDTA-Na2及抑肽酶抗凝,检测血清Ghrelin水平；②阳虚组：d42手术切除BAT,余同①组；③脾阳虚组：d49-d98高脂饲料(83%普通饲料,15%甘油三酯,2%胆固醇)在28℃和19℃环境交替喂养；余同②组；④中药组：d70-d98附子理中汤5ml/kg/d体重灌胃；余同③组。3结果(1)从各组体重增长率看,阳虚组与对照组相比体重增长减慢(P＜0.01)；脾阳虚组与对照组相比体重增长减慢(P＜0.01)；中药组与脾阳虚组相比,体重增长加快(P＜0.01)。(2)从各组血清Ghrelin含量看,脾阳虚组和对照组相比,血清Ghrelin含量明显降低(P＜0.01)；中药组与脾阳虚组相比,血清Ghrelin含量明显上升(P＜0.01)。4结论附子理中汤上调脾阳虚证大鼠血清Ghrelin水平,提高Ghrelin的双重调控的效能,从而改善脾阳虚症状：(1)附子理中汤上调Ghrelin,加强胃肠消化和吸收功能,这可能是附子理中汤“健脾”功效的神经内分泌基础之一。(2)附子理中汤上调Ghrelin.水平,提高食欲促进摄食、增加体重,这可能是附子理中汤“温阳”功效的神经内分泌基础之一。四、实验结论(一)脾阳虚证中能量代谢改变的特征依据上述脾阳虚证大鼠能量代谢的实验结果,进行多因素综合分析可以作出如下推断：1脾阳虚证大鼠能量代谢水平下降,荷能物质(血糖和甘油三酯)减少,能量分子(ATP)减少,体温下降。2机体在脾阳虚证时,面对能量代谢水平下降,通过整体、器官系统和细胞分子三个水平进行代偿性调节,不断进行自调节和自适应。在机体神经-内分泌-免疫网络的调控下,骨骼肌通过寒战前肌紧张、寒战产热、BAT的非寒战产热等措施,代偿能量代谢的下降。在细胞分子水平的表现是,BAT细胞线粒体UCP1和骨骼肌线粒体UCP3的代偿性产热；骨骼肌肌球蛋白ATP酶活性代偿性升高。(二)附子理中汤干预脾阳虚的生物学基础包括两个方面：1提高机体能量代谢水平,以达到温煦脾阳的目的。主要根据是附子理中汤干预后,与脾阳虚组相比,BAT的UCP1表达量升高、骨骼肌线粒体的UCP3表达量升高、骨骼肌肌球蛋白ATP酶活性升高。2提高脑肠肽Ghrelin水平,发挥对胃肠消化吸收功能和摄食、能量代谢的双重正调节效应,以恢复“脾主运化”和“脾主温煦”的功能。五、本课题研究的创新点(一)立足中医脾阳虚的传统理论,既考虑脾阳虚能量代谢失调方面,也考虑脾阳虚胃肠功能失调方面。采取“肩胛间BAT切除术+高脂饲料喂养+隔日寒冷环境刺激”的多因素序贯干预措施,时间较长,从整体上模拟人体脾阳虚的发生发展过程,建立的“脾阳虚证”证候模型,与人体脾阳虚证的表现吻合度较高,模型可靠。(二)以UCPs和能量代谢的关系为主要研究内容,重点观察UCP1、UCP3、能荷以及肌球蛋白ATP酶活性的改变特征,探讨脾阳虚证大鼠能量代谢低下、产热不足的机制。(三)选取Ghrelin为研究对象,从神经内分泌角度阐释其对脾阳虚证大鼠的作用及机制、调节方式,角度选取具有新颖性。