枣实蝇气味分子结合蛋白及其信息素的鉴定与应用研究

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为了研究枣实蝇Carpomya vesuviana Costa气味分子结合蛋白(odorant binding proteins)功能以及嗅觉作用机制,通过头部转录组测序及生物信息学分析首次获得枣实蝇嗅觉蛋白(olfactory protein);运用固相微萃取SPME和气质联用GC-MS方法收集并鉴定枣实蝇成虫及其寄主挥发物;结合触角电生理EAG反应,筛选出具有生理活性作用的挥发物;克隆表达及纯化气味分子结合蛋白OBP,完成了该蛋白与EAG反应活性挥发物结合亲和性研究;同源建模获得了枣实蝇OBP3分子模型。主要结果如下:通过对枣实蝇成虫头部转录组测序及序列拼装,共得到64662个unigenes,总长度为57187525 bp,平均长度约884 bp;其中有29298个unigenes(约占总unigenes的45%)能够被注释到不同的GO分类中,包括10382个unigenes注释到生物过程biological process 一项中,9516个unigenes注释到细胞组分cellular components 一项中,9400个unigenes注释到分子功能molecular functions一项中。首次从枣实蝇头部中鉴定并注释了 15个OR基因片段和22个GR基因片段,2个SNMP基因,2 个 CSP 基因;鉴定并注释了 6 个 OBP,其中 CvesOBP1、CvesOBP3、CvesOBP4、CvesOBP6属于“Classic”家族,CvesOBP2 和 CvesOBP5 属于“Minus-C”家族成员。运用SPME收集和GC-MS鉴定挥发物的方法,首次从枣实蝇雄性成虫中收集并鉴定出一种挥发物壬醛nonanal,该化合物能激起雄性成虫和雌性成虫触角EAG反应。从枣实蝇寄主枣果中收集并鉴定出5种挥发物,分别为花柏烯Chamigrene、石竹烯Caryophyllene、坎烯Camphene、乙酸叶醇酯(Z)-3-Hexen-1-ol acetate和罗勒烯Ocimene,这5种寄主挥发物也能够引起雄性和雌性成虫触角EAG反应。此外,地中海实蝇Ceratitis capitta的两种信息素物质乙酸香叶酯geranyl acetate和法呢烯α-famesene也能够同时引起枣实蝇雄性和雌性成虫触角EAG响应。林间诱捕效果表明,枣实蝇6种信息素物质诱捕效果好于黄板,其中壬醛引诱效果最佳。半定量PCR分析表明,枣实蝇6个OBP基因在头、胸、腹中均有不同程度的表达;CvesOBP1、CvesOBP2在翅中有表达,但表达量相对较低;CvesOBP1、CvesOBP5、CvesOBP6在足中也有表达。表达并纯化了 6个枣实蝇OBP蛋白,其中2个OBP以包涵体形式存在。通过荧光竞争结合试验,分析OBP蛋白与EAG反应活性挥发物之间的结合特性,其中CvesOBP5和6表现出对低分子量化合物较强的结合亲和性,CvesOBP2能够结合(Z)-3-hexenhexen-1-ol acetate,CvesOBP1和4表现出对caryophyllene和chamigrene的结合能力,CvesOBP3对a-famesene具有很强的结合能力同时也能在一定程度上对geranyl有结合亲和性。在枣实蝇OBP蛋白高级结构研究中只有CvesOBP3找到与之匹配度高的模板,能够建立三维模型。对模型评估发现,仅有5个氨基酸构象不合理,第66苯丙氨酸对构象稳定性影响最大。OBP3三维结构显示,存在6个a螺旋,结构非常紧凑,并且形成了结合囊腔,亲水性氨基酸残基位于囊腔外,疏水性氨基酸残基位于囊腔内部。
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